WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР для оценки экспрессии в ЭСК и гибридных клетках, а так же анализа химерных животных.

Ген/

маркер

Последовательность праймера,

от 5’ к 3’

Длина фрагмента, пн

MgCl2, мМ

Т отжига, °С

Actb

ACGCACGATTTCCCTCTCAGC

GGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCC

460

2,0

58

Oct4

CTCGAACCACATCCTTCTCT

GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC

312

2,0

58

Xist

ATCTAAGACAAAATACATCATTCCG

CTTGGACTTAGCTCAGGTTTTGTGTC

250

3,0

55

Gla

GTTCATGCAGATGGCAGAGC

CAGTGACAACCATCAAATTTTAGC

318

2,5

58

Nanog

GTGGTTGAAGACTAGCAATGG

CCAGATGTTGCGTAAGTCTC

462

2,5

55

Nanog

CACAGAGTAGTTCAGGAATAATTCC

CTTCGGGGAGGACTTTCTG

148

2.5

55

Gla

CCCAACGCTTTCCTAGTGGA

TGCAAGGCACAACCACGC

255

1,5

58

Catsper1

GGACAACCCATCAACAACACTT

GGTGACTGAACGGCGCAAT

131

2,5

55

D9Mit181

CCTCCCACAGTTCCTCATGT

CTGGTCTGGCCTCAGGTG

-

2,4

59

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка плюрипотентности клеточных гибридов с помощью маркеров недифференцированного состояния клеток.

Для первичной оценки плюрипотентности клонов серии НМС мы использовали маркеры недифференцированного состояния клеток, такие как: ферментативная активность щелочной фосфатазы (Wobus et al., 1984) и эмбриональный поверхностный антиген ЕСМА7 (Baribault, Kemler, 1989). Гистохимический анализ гибридных клеток показал, что клоны по доле АР+ колоний можно разделить на три условные группы. Первая, в которой более 70% АР+ колоний, вторая – 30-70%, и третья – менее 30%. При этом доля АР+ колоний в ЭСК линии НМ-1 составляла около 90%. 6 клонов были иммуногистохимически проанализированы на наличие экспрессии ЕСМА7. У всех клонов выявлено присутствие этого маркера. На основании этих данных можно предположить, что все клоны сохраняют плюрипотентность, однако часть из них имеет большую склонность к дифференцировке.

Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм.

Для тестов на химеризм были взяты контрастные по содержанию хромосом соматического партнера и общему количеству хромосом клоны гибридных клеток НМС15, НМС29 и субклоны НМС151, НМС154. У клона НМС15 и его субклонов общий набор хромосом варьирует от триплоидного до тетраплоидного, а количество хромосом M. caroli – от 1 до 3 (Matveeva et al., 2005; Vasilkova et al., 2007), тогда как клон НМС29 содержит 80% клеток с диплоидным и околодиплоидным набором хромосом и 13 хромосом M. caroli (Matveeva et al., 2005). Нами были получены химерные животные: от клеток клона НСМ15 – две химерные самки, от клеток клона НСМ29 – один химерный самец, от клеток субклона НМС151 – две самки и три самца и от клеток субклона НМС154 – самка и шесть самцов. Общая доля химерных животных для клонов немногим отличалась от таковой для контрольной линии ЭСК НМ1.

По окраске шерсти вклад клеток клона НСМ15 оценивался как 30% и 50%. Вклад потомков субклона НМС151 по окраске шерсти составлял 5%, тогда как у субклона НМС154 этот показатель варьировал в интервале от 5% до 30%. Вклад клеток клона НСМ29 по окраске шерсти оценивался как 5%. Для анализа вклада гибридных клеток в зародышевый путь были проведены скрещивания химерных животных с мышами линии C57Bl/J6 и CBA-Lac. В результате этих скрещиваний от каждого химерного животного было получено 4-5 полноценных потомств, однако не было получено ни одного потомка с фенотипом 129/Ola и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение).

Вклад ЭСК линии НМ-1 потомков ЭСК по окраске шерсти достигал 50%, однако от этих химер также не было получено потомков с фенотипом 129/Ola и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение).

Таблица 2. Анализ вклада гибридных клеток в ткани химерных животных

органы и ткани

гибридные клоны серии HMC

НМС15

НМС15-1

НМС15-4

НМС29

номер химеры

#9,

#21,

#22,

#24,

#25,

#11,

#12,

#13,

#14,

#15,

#16,

#3,

семенник или яичник

+

-

+

-

-

+

нт

+

+

+

+

-

селезенка

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

почка

+

+

+

-

+

+

-

-

-

-

+

+

печень

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

сердце

+

-

-

+

-

-

-

-

+

-

+

+

мозг

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

-

легкое

+

-

-

-

-

-

-

-

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»