WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

УДК 575.16

ПУЗАКОВ МИХАИЛ ВАСИЛЬЕВИЧ

ОЦЕНКА ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ СЛИЯНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СПЛЕНОЦИТОВ МЫШИ

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2007

Работа выполнена в Лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Серов Олег Леонидович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Стегний Владимир Николаевич

Томский государственный университет, НИИ биологии и биофизики, г. Томск

кандидат биологических наук,

Шевченко Александр Игоревич

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 19 сентября 2007 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «____» августа 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из фундаментальных проблем генетики развития является изучение плюрипотентности – способности клеток к дифференцировке в различные клеточные типы in vitro и in vivo, которая характерна для клеток эмбриона на ранних стадиях развития и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). То, какими механизмами осуществляется контроль над сохранением и утратой этого свойства в процессе дифференцировки клеток, к настоящему времени остается во многом неясным. С этим вопросом связана также не менее важная проблема, касающаяся эпигенетических изменений генома, происходящих при дифференцировке клеток, и возможности репрограммирования генома дифференцированных клеток взрослых животных. Долгое время считалось, что эмбриональные клетки очень рано теряют плюрипотентность, однако было показано, что пересадка ядер дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, в энуклеированные ооциты не препятствует нормальному развитию организма (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998). Таким образом, было установлено, что ядра дифференцированных клеток способны репрограммироваться и даже обеспечить полное развитие организма. Метод переноса ядер в последнее время широко применяется в клонировании млекопитающих и является очень эффективным способом репрограммирования ядер дифференцированных клеток. Однако существует альтернативный, не менее эффективный, экспериментальный подход к репрограммированию генома дифференцированных клеток, основанный на использовании высокого потенциала эмбриональных стволовых клеток, при их слиянии с дифференцированными клетками (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001).

В настоящее время ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются «связующим звеном» в исследованиях in vitro и in vivo. При культивировании ЭСК сохраняют плюрипотентные свойства в течение длительного времени, однако индукция дифференцировки in vitro приводит к образованию в культуре различных клеточных типов, соответствующих трем зародышевым листкам эмбриона. Более того, ЭСК, при введении в бластоцисту, принимают участие в образовании большинства органов и тканей химерных животных, в том числе и гонад (Tam, Rossant, 2003). Культуры ЭСК широко используются для изучения функции гена и для создания трансгенных животных, для исследования ранних этапов дифференцировки и сохранения плюрипотентности.

Для изучения плюрипотентности клеток применяют разносторонние методы. Для гисто- и иммуногистохимического анализа плюрипотентности используют маркеры, характерные для клеток ВКМ: активность щелочной фосфатазы и поверхностные антигены. Способность участвовать в формировании органов и тканей химерного животного (Tam, Rossant, 2003), а также в формировании тератом (Wobus et al., 1984) и эмбриоидных телец (Rastan, Robertson, 1985), является наиболее адекватным свидетельством высокого потенциала исследуемых клеток. По наличию экспрессии таких генов как Oct4, Sox2 и Nanog, «генов плюрипотентности», можно также оценить, являются ли клетки плюрипотентными.

Клеточные гибриды, получаемые слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, представляют уникальную экспериментальную модель, в которой гомологи с разным онтогенетическим статусом находятся в одном ядре. Гибридные клетки такого типа сохраняют плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне и, что очень важно, гены дифференцированного партнера репрограммируются в результате взаимодействия с геномом ЭСК (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Do, Schler, 2004). Одним из несомненных достоинств такой модельной системы является возможность создания набора гибридных клеток с разным соотношением родительских хромосом. То есть открывается возможность оценить роль индивидуальных хромосом в поддержании плюрипотентности и исследовать способность отдельных хромосом к репрограммированию. И хотя в большинстве работ гибридные клетки имеют около- или тетраплоидный кариотип (Tada et al., 2001, 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005), полного описания состава хромосом проведено не было.

Используемые в данной работе межвидовые клеточные гибриды серии НМС, полученные от слияния ЭСК Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M. caroli (Серов и др., 2003), имеют целый ряд преимуществ, наиболее важным из которых является детально описанный хромосомный состав (Matveeva et al., 2005; Пристяжнюк и др., 2005). Результаты подсчета хромосом показали, что их количество варьирует в широких пределах, как внутри каждого клона, так и между клонами – от околодиплоидного до околотетраплоидного. В большинстве клонов среднее число хромосом было существенно ниже тетраплоидного, что указывает на сегрегацию хромосом, имевшую место в период от момента слияния клеток до момента цитогенетического анализа. Цитогенетический и микросателлитный анализ продемонстрировали сохранение всех маркеров хромосом M. musculus и значительное разнообразие по содержанию хромосом M. caroli – от нескольких до полного диплоидного соответствия. Более того, некоторые гибридные клоны, будучи тетраплоидными, содержали одну или несколько хромосом соматического партнера вследствие «скрытой» сегрегации (Пристяжнюк и др., 2005).

Другое преимущество гибридных клонов серии HMC состоит в том, что использование в клеточной гибридизации разных, но близкородственных видов, облегчило поиск генетических различий в кодирующих участках генов и позволило нам надежно маркировать аллельные варианты разного родительского происхождения.

Благодаря используемой нами экспериментальной модели появилась возможность для более полной оценки плюрипотентности и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом и присутствием хромосом соматического партнера.

Цель и задачи работы

Цель работы заключалась в оценке плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши M. musculus и спленоцитов M. caroli.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток in vitro с помощью маркеров, характерных для недифференцированных клеток: активности щелочной фосфатазы и эмбрионального поверхностного антигена ЕСМА-7.

2. Сравнить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток в экспериментах in vivo – получение химерных животных, с последующей оценкой вклада гибридных клеток в формирование тканей и органов химер.

3. Изучить в клонах межвидовых гибридных клеток экспрессию генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

4. Сравнить экспрессию родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках и, тем самым, оценить способность к репрограммированию генома дифференцированных клеток взрослого животного.

5. Оценить активность Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведено комплексное исследование плюрипотентности межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток мышей M. musculus линии 129/Ola и спленоцитов M. caroli. Для оценки плюрипотентности использовали молекулярные, гисто- и иммуногистохимические маркеры, а также тест на получение химерных животных. Показано, что уровень плюрипотентности в гибридных клетках типа ЭСК-спленоцит мало зависим или полностью независим от числа хромосом соматического партнера в гибридном кариотипе, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак.

2. В данной работе впервые описаны химерные животные, полученные микроинъекционным способом с использованием межвидовых клеточных гибридов серии НМС. Показано сохранение хромосом соматического партнера в потомках гибридных клеток при развитии химерного организма.

3. В гибридных клетках серии НМС впервые проведен анализ активности Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, и показано отсутствие предпочтительной инактивации Х-хромосом при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Положения, выносимые на защиту. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток M. musculus со спленоцитами взрослой самки M. caroli, показано присутствие активности щелочной фосфатазы и эмбрионального антигена ЕСМА-7 (маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам) и «маркеров плюрипотентности» Nanog и Oct4. Показана реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla M. caroli, неактивных в геноме спленоцитов. Анализ экспрессии генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Ххромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю». Установлено, что клоны гибридных клеток, содержащие единичные хромосомы M. caroli и клоны с высоким содержанием хромосом M. caroli, способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных. Полученные данные свидетельствуют о сохранении плюрипотентности у гибридных клеток серии НМС на уровне сходным с ЭСК и, более того, о доминировании этого свойства у клеточных гибридов такого типа.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о процессах поддержания плюрипотентности и репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в НГУ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах, содержит 16 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы культуры клеток: ЭСК, линии НМ1 (ГФРТ; ХУ); 20 первичных ГАТ-резистентных клонов межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных от слияния ЭСК линии НМ1 мыши M. musculus и спленоцитов мыши M. caroli (ГФРТ+; ХХ) (Серов и др., 2003). Кроме того, в работе использовали 2 субклона гибридного клона НМС15. Культивирование клеток проводили по методу описанному ранее (Matveeva et al., 1998, 2005).

Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы проводилось согласно методу описанному ранее (Pain et al., 1996). Для оценки активности щелочной фосфатазы на окрашенных препаратах подсчитывалось число колоний клеток различного типа: состоящие из окрашенных клеток (АР+), из неокрашенных клеток (АР–) и как из окрашенных, так и неокрашенных клеток (АРсм), общая выборка составляла 500-700 колоний. Затем подсчитывалась доля колоний каждого типа.

Иммуногистохимическое выявление экспрессии ECMA7 (Baribault H., Kemler R., 1989).

Для получения эмбриоидных телец in vitro культуру клеток трипсинизировали и суспендировали стандартным способом. Клеточную суспензию высевали на обработанные 1% агарозой чашки в ростовую среду, не содержащую LIF (Robertson, 1997; Matveeva et al., 1998). Эмбриоидные тельца брали в анализ на 9-12 сутки.

Для получения химерных животных 10-20 ЭСК или гибридных клеток инъецировали в реципиентные бластоцисты мышей линии C57Bl/J6. Инъецированные бластоцисты трансплантировали реципиентным псевдобеременным самкам F1 (C57Dl/J6 x CBA-Lac) (Matveeva et al., 1998).

Вклад ЭСК и гибридных клеток в ткани химерных животных оценивали с помощью биохимического выявления аллельных вариантов глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) (DeLorenzo, Ruddle, 1969).

Выделение ДНК из клеток проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, USA), из эмбриоидных телец ДНК выделяли с использованием Trizol Reagent (Life Technology, USA) согласно рекомендациям производителя и из тканей животных – фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984).

Тотальную РНК из клеток, эмбриоидных телец, а также из тканей взрослых мышей выделяли с использованием Trizol Reagent (Life Technology, USA) согласно рекомендациям производителя.

Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription System (Promega, USA) по методу производителя.

Реакционная смесь ПЦР объемом 25 мкл содержала ПЦР буфер (65 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16 мМ (NH4)2SO4 и 0,01% Tween 20), 1,5-3,0 мМ MgCl2 (табл. 1), 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотида (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), по 1 мкМ обоих праймеров (табл. 1), 0,5 ед. Taq ДНК полимеразы и 50-500 нг ДНК. Условия ПЦР включали исходную денатурацию геномной ДНК в течение 3 мин при 95°С, 30 циклов амплификации (денатурация 30 сек при 95°С, отжиг праймеров 15-30 сек при Т указанной в таблице 1, элонгация 20 сек при 72°С), элонгация в течение 3 мин при 72°С. Для электрофоретического разделения фрагментов ДНК использовали 3% агарозный гель.

Рестрикционный анализ проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл содержащей 17 мкл раствора амплифицированной ДНК, 100 мкг/мл BSA, 2 мкл десятикратного буфера для соответствующей рестриктазы и 5 ед. фермента. Использовали эндонуклеазы рестрикции PstI, DraI, HinfI (СибЭнзим, Россия) и HhaI (Promega, USA). Смесь инкубировали в течение 2 ч при 37°С.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»