WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Внедрение результатов исследования. Основные результаты внедрены в работу физиотерапевтических отделений ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», ГКБ № 14 им. В.Г. Короленко г. Москвы, кожного и поликлинического отделений Омского областного клинического кожно-венерологического диспансера, физиотерапевтического и лечебно-диагностического отделений клиники кожных и венерических болезней ГОУ ВПО Саратовского ГМУ Росздрава. Результаты исследований используются в учебном процессе курса детской дерматологии кафедры детских инфекционных болезней ГОУ ДПО РМАПО Росздрава, Центра последипломного образования и кафедры дерматовенерологии Омской государственной медицинской академии. На основании результатов исследования подготовлены и утверждены 2 медицинские технологии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (г. Москва, 2005), II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (г. Санкт-Петербург, 2007), VI Международном конгрессе KOSMETIK international им. Е. Лапутина (г. Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные аспекты соматической патологии у детей» (г. Москва, 2008), Х Всероссийском съезде дерматовенерологов (г. Москва, 2008), научно-практической конференции ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий» (г. Москва, 2009).

Публикации. По материалам исследований опубликована 21 печатная работа, из них 8 в журналах, рекомендованных ВАК России.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 26 таблицами и 23 рисунками, состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов, глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы, включающего 49 отечественных и 206 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 135 больных витилиго (93 - женского пола, 42 – мужского пола) в возрасте от 7 до 60 лет. Критериями включения больных в исследование являлись возраст старше 7 и моложе 80 лет, наличие типичной картины заболевания, отсутствие противопоказаний для ультрафиолетовой терапии. Клиническое обследование больных включало изучение анамнеза жизни и заболевания, оценку общего и локального статуса. У каждого больного определяли площадь депигментации, которую измеряли по планиметрической методике (Gowland Hopkins N.F. и Jamieson C.W., 1983) или правилу девяток, а также оценивали активность витилиго, используя шкалу VIDA (Njoo M.D., 1999). Для исключения сопутствующих заболеваний и противопоказаний к лечению больные были консультированы педиатром, терапевтом, офтальмологом, эндокринологом, гинекологом, по показаниям - другими специалистами. Всем больным проводили лабораторное обследование, включавшее общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови.

У 16 больных вульгарным витилиго в биоптатах кожи, взятых из 3-х зон очагов поражения: зоны депигментации, краевой зоны (пограничной с очагами) и зоны перифокальной нормально пигментированной (видимо здоровой) кожи, иммуногистохимическим методом проведено изучение содержания и распределения в эпидермисе и дерме меланосомального белка Melan A, меланинсодержащих клеток, основных субпопуляций Т-клеток - CD4+ и CD8+ лимфоцитов, активированных CD25+ и HLA-DR+ клеток, а также СD1a+ и CD83+ дендритных клеток. У 11 больных иммуногистохимические исследования проведены до и после узкополосной средневолновой ультрафиолетовой терапии с длиной волны 311 нм. Биоптаты кожи после лечения брали из участков ранее поражённой кожи, расположенных рядом с местом предыдущей биопсии. Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев в возрасте от 29 до 64 лет.

Всего изучено 680 иммуногистохимических препаратов. Исследования проводили на парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой в СВЧ-печи и применением проявляющей системы Novostain super ABC Kit (universal). Для иммунофенотипирования использовали мышиные моноклональные антитела (Novocastra Laboratories Ltd, Великобритания), специфичные к Melan-A (клон А103) – меланоцитарному маркеру, CD25 - маркеру a-цепи рецептора ИЛ-2, HLA-DR - молекуле главного комплекса гистосовместимости II класса, CD4 - маркеру субпопуляции Т-хелперов/индукторов, CD8 - маркеру субпопуляции супрессорно-цитотоксических Т-клеток, CD1a - маркеру клеток Лангерганса, CD83 - маркеру дендритных клеток. Меланинсодержащие клетки выявляли путем гистохимической окраски срезов по методу Fontana-Masson (Лили Р., 1969). Подготовленные препараты изучали в световом микроскопе «Nikon Eclipse E 600», изображение документировали цифровой камерой «Nikon D 100».

Количество MelanA+ и меланинсодержащих клеток, CD4+ и CD8+ лимфоцитов, CD1a+ и CD83+ клеток в эпидермисе определяли в поле зрения из расчета на 100 базальных кератиноцитов. Содержание CD25+ и HLA-DR+ клеток в эпидермисе оценивали полуколичественным методом и выражали в баллах. При оценке содержания CD25+ клеток 0 баллов соответствовало отсутствию экспрессии антигена CD25, 1 балл – наличию экспрессии. При анализе количества HLA-DR+ клеток 1 балл соответствовал слабой экспрессии антигена, 2 балла – выраженной его экспрессии. Оценку во всех препаратах проводили в 5 полях зрения, после чего для каждого биоптата рассчитывали среднее значение изучаемых показателей.

При исследовании содержания CD4+, CD8+, CD25+, CD1a+, CD83+ клеток в дерме в 5 периваскулярных инфильтратах произвольно выбирали по 20 клеток, среди которых проводили подсчет количества меченых клеток, после чего для каждого препарата рассчитывали среднее значение относительного содержания клеток. Содержание HLA-DR+ клеток в дерме оценивали, как и в эпидермисе (в баллах).

У 99 больных изучена эффективность лечения витилиго узкоспектральным ультрафиолетовым излучением диапазона 304-313 нм. Из них 74 пациента получали терапию узкополосным средневолновым излучением с длиной волны 311 нм, 25 больных - ультрафиолетовым эксимерным лазером с длиной волны 308 нм. Для сравнения у 36 больных проведен ретроспективный анализ эффективности лечения витилиго методом ПУВА-терапии с пероральным применением фотосенсибилизаторов.

Узкополосную (311 нм) средневолновую ультрафиолетовую терапию проводили в ультрафиолетовой кабине Waldmann UV 7001К «Herbert Waldmann GmbH & Co. KG» (Германия) с использованием ламп TL-01, излучающих в диапазоне 310-315 нм с максимумом эмиссии на длине волны 311 нм. Для лечения ультрафиолетовым лазерным светом использовали эксимерную лазерную систему XTRAC XL PLUS производства фирмы PhotoMedex, Inc (США), генерирующую эксимерное ультрафиолетовое излучение с длиной волны 308 нм, частотой следования импульсов до 200 Гц, длительностью импульсов 30 нс, плотностью энергии в импульсе 2-3 мДж/см2. Размеры излучающей головки составляли 2 на 2 см.

Эффективность терапии оценивали после окончания курса лечения по динамике площади поражения с вычислением процента репигментации. За улучшение принимали репигментацию кожи на площади, составляющей не менее 15-50% от первоначальной площади поражения, за значительное улучшение - репигментацию 51-95% площади очагов поражения, за клиническое выздоровление – репигментацию 96-100% площади очагов. Отсутствие эффекта констатировали при восстановлении пигментации на площади, занимающей менее 15% от исходной площади поражения. При лечении ультрафиолетовым эксимерным лазером, кроме оценки эффективности лечения всей пораженной кожи больного, процент репигментации определяли в каждом отдельно взятом очаге витилиго. Отдаленные результаты лечения оценивали по стойкости пигментации и отсутствию прогрессирования заболевания.

Статистический анализ данных выполняли с использованием пакета программ Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., США) в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002). Описательная статистика количественных признаков представлена средними и среднеквадратическими отклонениями (в формате M+s в случае нормальных распределений) либо медианами и квартилями (в формате Me [Q1; Q3]). Описательная статистика качественных признаков представлена абсолютными и относительными частотами. Для сравнения несвязанных групп по количественным и порядковым признакам применяли тест Манна-Уитни, для сравнения связанных групп (анализа признаков в динамике) – тест Вилкоксона. Сравнение несвязанных групп по качественным признакам осуществляли с использованием теста Хи-квадрат и точного критерия Фишера. Корреляционный анализ проводили непараметрическим методом Спирмена. При проверке гипотез статистически значимыми результаты считались при достигнутом уровне значимости P<0,05. При множественных сравнениях применяли поправку Бонферрони, согласно которой пороговый уровень значимости рассчитывался по формуле 0,05/n, где n – число выполненных статистических тестов. Статистически значимыми результаты считались при рассчитанном уровне значимости (РБ), меньшем порогового уровня значимости, определенного с учетом поправки Бонферрони.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В исследование было включено 135 больных витилиго (93 женского пола и 42 мужского пола) в возрасте от 7 до 60 лет (медиана 24 года). Продолжительность заболевания варьировала от 1 месяца до 42 лет (в среднем 9,5 лет). Вульгарная форма заболевания диагностирована у 107 больных (79,3%), сегментарная – у 13 (9,6%), фокальная – у 11 пациентов (8,2%), акрофациальная – у 3 больных (2,2%), универсальная - у 1 больного (0,7%). Величина индекса VIDA варьировала от -1 до 4 баллов (медиана 2 балла). Стационарная стадия заболевания констатирована у 32 пациентов (23,7%), стадия прогрессирования - у 91 больного (67,4%); 12 пациентов (8,9%) отмечали спонтанную репигментацию. Площадь очагов поражения составляла от 0,02 до 85%. Сто двадцать семь больных (94%) имели III тип кожи, 6 больных – II тип кожи, 2 пациентов - IV тип кожи. У 24 пациентов (17,7%) наблюдали от одного до нескольких невусов Сеттона. Обесцвеченные ресницы, брови, волосы на голове встречались у 40 больных (29,6%). Семейные случаи заболевания имели место у 37 пациентов (27%). У 25 больных (18,5%) выявлены заболевания желудочно-кишечного тракта, у 11 (8%) - щитовидной железы, у 5 (3,7%) - ЛОР-органов, у 6 (4,4%) - аллергические заболевания кожи и дыхательных путей.

Иммуногистохимические исследования с определением в коже Melan A+ клеток, меланинсодержащих клеток, CD4+ и CD8+ лимфоцитов, активированных CD25+ и HLA-DR+ клеток, СD1a+ и CD83+ дендритных клеток проведены у 10 здоровых добровольцев и 16 больных вульгарным витилиго (11 женщин и 5 мужчин) в возрасте от 24 до 52 лет (медиана 38 лет). У всех пациентов установлена прогрессирующая стадия витилиго, продолжительность заболевания варьировала от 1,5 до 42 лет (медиана 12 лет), площадь поражения - от 5 до 50% поверхности тела (медиана 20%). Группа больных и группа здоровых добровольцев не отличались статистически по возрасту и полу (соответственно P=0,200 и P=0,130).

Особенности нарушений меланогенеза в очагах витилиго. В группе здоровых лиц меланосомальный белок Melan-A и гранулы меланина были обнаружены во всех препаратах кожи (табл. 1). Экспрессия белка Мelan-A выявлялась в клетках базального слоя эпидермиса, гранулы меланина встречались в клетках базального и супрабазальных слоев. У больных витилиго Melan-A+ и меланинсодержащие клетки обнаружены в депигментированной коже, соответственно, у 6 (37,5%) и 9 (56,3%) пациентов с продолжительностью заболевания от 21 месяца до 42 лет. Melan-A+ клетки во всех трех зонах очагов витилиго выявляли в базальном слое эпидермиса, в том числе в интерфолликулярном эпителии. В зоне депигментации обнаруживали отдельные позитивно окрашенные клетки в пределах биоптата. В краевой зоне и зоне перифокальной нормально пигментированной кожи их количество возрастало до 5-7 клеток на 100 кератиноцитов базального слоя. При статистическом анализе в очагах витилиго выявлено сниженное количество Melan-A+ клеток, по сравнению со значением в коже здоровых добровольцев (табл. 1). Уменьшенное содержание Melan-A+клеток установлено не только в зоне депигментации и краевой зоне, но и в зоне перифокальной нормально пигментированной кожи: количество иммунореактивных клеток в ней было в 3 раза меньше, чем в коже здоровых добровольцев (РБ<0,001). Полученные нами данные согласуются с результатами исследований I.C. Le Poole с соавторами (1996), обнаружившими более, чем двукратное снижение в данной зоне экспрессии меланоцитарного маркера NKI-beteb. Вместе с тем, в зоне депигментации содержание Melan-A+ клеток было статистически значимо ниже, чем в перифокальной нормально пигментированной коже (РБ<0,001).

Наряду с нарушениями содержания Melan-A+ клеток в коже больных, в зоне депигментации обнаружено уменьшенное количество меланинсодержащих клеток (табл. 1, РБ<0,001). Гранулы меланина выявляли в зоне депигментации в отдельных участках базального слоя, в краевой зоне - почти на всем его протяжении, в зоне перифокальной нормально пигментированной кожи - на всем протяжении базального слоя и в супрабазальном слое эпидермиса.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о сохранении в интерфолликулярном эпителии зоны депигментации очагов витилиго резидуальных меланоцитов (в том числе у больных с большой продолжительностью заболевания), а также вовлечении в патологический процесс перифокальной нормально пигментированной кожи.

Таблица 1.

Содержание Melan-A+ клеток и меланинсодержащих клеток в эпидермисе больных витилиго и здоровых добровольцев (количество клеток на 100 базальных кератиноцитов, медианы и квартили)

_______________________________________________________________________________________________________

Популяции Здоровые Больные витилиго (n=16)

клеток добровольцы Зона Зона Зона

(n=10) депигментации краевая пигментированной Р1 Р2 Р3

кожи _______________________________________________________________________________________________________

Melan-A+ клетки 10,9 [9,6; 12,6] 0 [0; 1] 1,0 [0,2; 2,6] 3,4 [2,5; 5,2] <0,001* <0,001* <0,001*

Меланин+ клетки 52 [38,4; 100,2] 1 [0; 7,8] 18,1 [5,6; 55,9] 54,6 [40; 65,1] <0,001* 0,013 0,598

_______________________________________________________________________________________________________

Примечание: Melan-A+ - клетки, экспрессирующие антиген Melan-A (выявление моноклональными антителами A103).

Меланин+ - клетки, содержащие гранулы меланина (окраска по методу Fontana-Masson).

Р1, Р2 и Р3 – уровни статистической значимости при сравнении показателей здоровых добровольцев и больных,

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»