WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

из культуры печени опытной серии (Nоп.)

45,0±3

32,0±2

38,3±3

29,2±2

32,0±

30,0±2

17,5±1

21,0±1

19,0±1

19,0±1

13,0±2

22,0±2

144.2%±3,8%

Нормы качества разработанных таблеток приведены в таблице 5

Таблица 5

Оценка качества разработанных таблеток

Наименование показателей

Характеристика и норма

Внешний вид

Плоскоцилиндрической формы таблетки серовато-белого цвета, одинакового размера, с ровными без сколов краями.

Подлинность

Наличие гликопротеина печени определяется биотестированием

Вкус раствора

Кисло-сладкий

Внешний вид раствора

Прозрачная жидкость

Запах раствора

Цитрусовый (лимон)

Размеры, мм

Диаметр 2±0,1, высота 1 ± 0,1

Прочность на сжатие, Мпа

0,23

Прочность на истирание, %

менее 15

Распадаемость, мин

не более 0,4

Средняя масса таблеток, мг

9 ± 0,5

Результаты контроля микробиологической чистоты разработанного средство представлены в таблице 6.

Таблица 6

Микробиологические показатели чистоты разработанных тритурационных таблеток

Определяемые показатели

Гигиенический норматив

Единицы измерения

НД на методы исследований

Результаты анализа

КМАФАнМ

5*104

КОЕ/г

ГОСТ 10444.15-94

соответствует

БГКП (колиформы)

не допускается

в 0,01 г

ГОСТ Р 50474-93

ГОСТ Р 30518-97

соответствует

E. Coli

не допускается

в 1,0 г

ГОСТ 30726-2001

соответствует

Патогенные, в том числе сальмонеллы

не допускается

в 10,0 г

ГОСТ 50480-93

соответствует

Дрожжи и плесени

не более 100

КОЕ/г

ГОСТ 10444.12-88

соответствует

Обобщенная схема технологического процесса приведена на рисунке 8.

Рис. 8. Обобщенная схема технологического процесса получения лечебно-профилактического средства - «Гепотрит»

Фармакологические исследования субстанции регуляторных белков печени КРС и препарата, разработанного на их основе

Изучение биологической активности исходной субстанции in vitro на модели Paramecium caudatum

Биологическое действие исходной субстанции испытывали на культуре Paramecium caudatum, выращенной на среде Л.К. Лозина-Лозинского. Особенностью применения данной методики явллось её использование для исследования биологическихобъектов животного происхождения. что позволило выявить наличие дозозависимого эффекта субстанции. В хроническом опыте определяли влияние исследуемого вещества на аппарат размножения и темп роста парамеций. Исследовалась субстанция регуляторного белка в интервале доз от до мг белка/мл. Опыт проводился в течении 24 суток.

Наибольшая плотность инокулята во всех дозах наблюдается на 4-5 день культивирования (рис. 9), причем максимальное количество особей в одной капле субстанции, взятой в дозировке 10-12 мг белка/мл, существенно превышало контроль (соответственно 260±8 и 15±2 особи).

Рис. 9. Зависимость плотности инокулята от концентрации субстанции КРС

Пики плотности инокулята приходятся на концентрации 10-12, 10-21, в интервале концентраций 10-15 - 10-16 наблюдается нечетко выраженное экстремальное значение.

Затем был поставлен хронический опыт с тремя веществами гепатопротекторного действия: исследуемой субстанцией регуляторного белка и референтными гепатопротекторами – эссенциале и лецитином (рис. 10). Дозы у препаратов были взяты от 10-12 до 10 -24 мг/мл, кроме того лецитин и эссенциале исследовали в обычных терапевтических дозах. Максимальная плотность инокулята в терапевтических дозах лецитина составила 11, эссенциале – 0, что обусловлено токсичностью препарата.

Рис. 10. Зависимость плотности инокулята от дозы гепатопротекторов

Все три препарата проявляют высокоактивное стимулирующее действие на интенсивно размножающихся парамеции, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Зависимость «доза-эффект» носит немонотонный, полимодальный характер. В интервале доз 10-18–10-20, 10-22–10-24 эффект отсутствует. У всех трех препаратов резкое возрастание эффекта наблюдается в концентрации 10-21 мг/мл. Полученные результаты коррелируют с результатами исследования «доза – эффект» вязкоупругих свойств плазматической мембраны гепатоцитов.

На основании вышеизложенного можно предположить, что плотность инокулята обусловлена мембранотропным эффектом гепатопротекторных препаратов. Аналогичное действие эти препараты оказывают и на мембраны гепатоцитов, непосредственно встраиваясь в фосфолипидную структуру поврежденных мембран, т.е. косвенно подтверждается гепатопротекторный эффект исследуемого средства.

Изучение гепатопротекторной активности in vitro с использованием первичной культуры гепатоцитов

Скрининговые исследования полученной субстанции кислого регуляторного белка проводили на первичной культуре изолированных гепатоцитов. В качестве препаратов сравнения брали растворы эссенциале и карсила. Воспроизводилась модель поражения клеток в культуре. Моделировалось поражение печени лекарственным средством - индометацином.

Для применяемой культуры клеток был определена LC50. Оценка действия индометацина на клетки в культуре проводилась по их выживаемости (рис.11).

Рис. 11. Оценка выживаемости гепатоцитов в первичной культуре под воздействием индометацина в зависимости от концентрации

Индометацин в концентрации 5,33 мкг/мл привел к гибели 47,06% клеток в культуре. Для выбранных гепатопротекторов определяли ЕС50. Наиболее эффективной концентрацией для эссенциале является 0,3 мкг/мл культуральной среды. Эта концентрация обеспечивает при использовании EC50 индометацина выживаемость 92,31% гепатоцитов. Эффективная концентрация карсила составляет 1,725 мкг/мл культуральной среды. При использовании индометацина в концентрации EC50 выживаемость гепатоцитов составляет 80,77%.

Эффективная концентрация исследуемого регуляторного белка печени (РБП) – 10-12 мкг/мл культуральной среды. При этом наблюдается 84% выживаемости гепатоцитов. Следующее экстремальное значение выживаемости - 66,67% наблюдается при концентрации 10-21. Зависимость «доза – эффект» по РБП коррелируется с результатами по исследованию воздействия регуляторного белка печени на аппарат размножения Paramecium caudatum.

Рис. 12. Зависимость жизнеспособности гепатоцитов на модели интоксикации индометацином

Степень жизнеспособности гепатоцитов под воздействием индометацина было различной и характеризовалась следующим образом: эссенциале > регуляторный белок печени > карсил (рис. 12).

Первичная оценка гепатозащитной активности субстанции кислых регуляторных белков печени in vivo

Первичная оценка гепатозащитной активности полученной субстанции кислых РБП проводилась на модели острого ССl4 гепатоза при их лечебно – профилактическом введении. В исследованиях гепатозащитного действия оценивались следующие параметры: выживаемость животных, динамика изменения массы тела, коэффициент массы печени, длительности гексаналового сна и степень жировой дистрофии печени.

В группе негативного контроля выживаемость животных снижена до 83,3% (табл.7). При применении исследуемых препаратов выживаемость составила 100%.

Несмотря на отсутствие достоверных различий в динамике массы тела между крысами групп, получавших гепатозащитные средства, более выраженной была потеря массы тела в группе, получавшей карсил.

В группе крыс, отравленных ССl4, отмечалось достоверное увеличение удельной массы печени (табл. 7), удельная масса печени леченых животных в среднем на 12% меньше.

При лечебно-профилактическом применении РБ печени продолжительность гексаналового сна достоверно снижается на 25,5%.

Раствор регуляторного белка ослабил стеатоз печени до 2,4-3,6 баллов.

В проведенной серии экспериментов регуляторный белок печени обладает выраженным гепатозащитным действием в условиях острого ССl4 гепатоза.

Таблица 7

Функциональные и метаболические показатели печени при остром ССl4 гепатозе

Экспериментальные группы

Выживаемость, %

Изменение массы тела, %

Удельная масса печени, г

Степень жировой инфильтрации печени

Интактные животные

100

5,49±1,65

50,95±1,1

 

ССL4 - гепатит

83,33

-9,15±0,72 Р*=0

62,08±1,5 Р*=0

4,2±0,3 Р*=0

РБ печени

100

-4,42±1,99 Р*=0,04, Р**=0,49

56,7±3,2 Р*=0,121, Р**=0,16

3,0±0,6 Р*=0, Р**=0,082

Карсил

100

-5,84±0,26 Р*=0, Р**=0,007

55,9±4,1 Р*=0,274, Р**=0,188

3,2±0,5 Р*=0,04, Р**=0,09

Р*<0,05 достоверное отличие от группы интактного контроля

Р*<0,05 достоверное отличие от группы негативного контроля

Эффективность действия сравнима с карсилом и по ряду показателей незначительно и недостоверно его превышает.

Оценка терапевтической эффективности препарата на модели экспериментального поражения печени

Терапевтическую эффективность разработанного препарата определяли на модели острого токсического ССl4 гепатоза у крыс.

Гипербилирубинемия у больных с токсическим поражением печени является следствием воздействия яда на активность фермента трансглюкуронидазы. Исходная норма содержания билирубина в сыворотке крови составила 17,97±1,88 мкмоль/л. Под воздействием токсиканта обнаружен достоверный резкий подъем содержания общего билирубина почти в пять раз. Исследуемый препарат снизил концентрацию билирубина на 56,9%, карсил – на 69%.(рис.13)

Рис. 13. Содержание билирубина в сыворотке крови при остром ССl4 гепатозе

При цитолизе паренхимы печени возрастает проницаемость клеточной мембраны гепатоцитов, возрастает уровень аланинаминотрансферазы (АлАт). В наших экспериментах тетрахлорметан повышал активность АлАт более чем в 8,3 раза (при норме 0,18±0,01 ммоль/(г*л). Исследуемые гепатопротекторы ограничивали выход в кровь аланинаминотрансфераз: исследуемый препарат – на 48,2 %, карсил – на 18,2% по сравнению с показателями у нелеченных животных (рис.14).

Рис. 14. Содержание АлАт в сыворотке крови при остром ССl4 гепатозе

Активность ЩФ в сыворотке крови интактных крыс составила 183,6±41,46 мкмоль /(мин*л). При интоксикации тетрахлорметаном элиминация в кровь щелочной фосфотазы осуществлялась со скоростью в четыре раза превышающую диффузию этого фермента через синусоидальную мембрану гепатоцитов у интактных крыс. Исследуемый препарат снижал активность ЩФ на 62,5%, карсил – на 69,9% по сравнению с соответствующим показателем группы негативного контроля (рис.15).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»