WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Коэффициент разобщенности

Интактная печень

3 ± 1

10 ± 1

0,2307

Печень, экстрагированная раствором Рингера

10 ± 2

3 ± 1

0,7692

Печень, экстрагированная физиологическим раствором

2± 1

10 ± 2

0,1666

Суспензия гепатоцитов

13 ± 1

0 ± 1

~ 1

Экстрагирование в растворе Рингера обеспечивало наименьшую адгезию гепатоцитов.

Учитывая ионообменные адсорбционные свойства межклеточных компонентов следует использовать экстракт с ионной силой близкой к физиологической, и с соответствующим значением рН. Для поддержания постоянного кислотно-щелочного баланса среды в раствор Рингера добавляли буфер HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazone-H-2-Ethanesulfonic Acid).

Был установлен оптимальный состав экстрагента: 147 мМ NaCl; 4 мМ KCl; 2,25 мМ CaCl2; 1мМ HEPES.

Затем определяли рациональный температурный режим процесса экстрагирования. Зависимость коэффициента разобщенности гепатоцитов от температуры, установленная эмпирическим путем, представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Зависимость коэффициента разобщенности от температуры

Коэффициент разобщенности максимален при температуре +2 С. Учитывая нижний предел температур промышленных установок, целесообразно температуру экстрагирования выбирать +3, +4 С.

Оптимальным способом экстрагирования, соответствующим специфике требований к извлечению регуляторных белков, является ремацерация.

Количество ступеней ремацерации рассчитывали по формуле:

где М – отношение общего и задержанного в сырье экстракта, М- суммарная эффективность ремацерации.

Таблица 2

Суммарная эффективность ремацерации

Эффективность ремацерации Е (суммарная)

Исходное сырье (печень КРС), г

Общее количество экстрагента, мл

Поглощенный экстрагент, мг

М

Количество ступеней ремацерации

1

2

3

1010

750

86

8,721

0,885

0,987

0,998

995

750

80

9,375

0,893

0,989

0,999

1005

750

85

8,824

0,887

0,987

0,999

1025

750

93

8,065

0,876

0,985

0,998

990

750

90

8,333

0,880

0,986

0,998

1001

750

98

7,653

0,869

0,983

0,998

Как следует из приведенных данных (табл. 2), необходимая эффективность достигается по истечении второй ступени ремацерации.

Влияние времени экстрагирования на процесс извлечения регуляторного белка изучали при температуре 3С и продолжительности контакта фаз сырье-экстрагент от 0,5 час до 3,5 час на первой ступени и от 0,5 час до 2,5 час – на второй. Максимальная полнота извлечения белков на первой ступени ремацерации достигается при экстрагировании в течение 2,5 часов, на второй ступени – 1,5 часов. Суммарное время экстрагирования составило 4 часа.

Для очистки извлечения использовали центрифугирование. Скорость центрифугирования определяли, как обеспечивающую полное разделение фаз, спектрофотометрически, по равенству оптических плотностей чистого экстрагента и экстракта после центрифугировании. Оптимальная скорость центрифугирования составила 3500 g, время центрифугирования составило 10 мин.

При высаливании тканевого экстракта, регуляторные белки остаются в растворенном состоянии в насыщенном растворе соли, а примесные белки переходят в осадок.

С целью предотвращения контаминации микроорганизмами и порчи сырья использовали консерванты: гермаль 115- 0,5%, парабены: нипагин 0,4%, нипазол 0,4%, которые вводились в состав сырья уже на стадии высаливания.

Для определения оптимального времени высаливания из раствора отбирались пробы через каждые 3 часа. В каждой из проб определялось количество общего белка в надосадочной жидкости. Процесс высаливания белка останавливали при стабилизации содержания белка (рис. 3).

По истечению 35 часов высаливания концентрация белка в надосадочной жидкости стабилизировалась, содержание белка уменьшилось на 52,2%. Остаток соосажденных белков убирали центрифугированием. Наиболее полное разделение происходило на скорости 14500 g.

Рис. 3. Изменение концентрации белка в процессе первого высаливания

Диализ выполняли против очищенной воды для удаления низкомолекулярных примесей и сульфата аммония. После девяти замен приемной жидкости качественная реакция на сульфат аммония была отрицательной.

Затем определяли время одной ступени диализа. Для количественного определения сульфат - ионов использовали гравиметрический метод. Как следует из приведенных данных (рис. 4), после 20 часов диализа при температуре 4С наступает равенство концентраций в камерах диализатора.

Рис. 4. Изменение концентрации сульфат – ионов в процессе диализа

С целью интенсификации процесса диализа применяли магнитную мешалку. Динамика изменения концентрации соли представлена на рисунке 5.

Рис. 5. Зависимость скорости диализа от интенсивности перемешивания

При использовании магнитной мешалки оптимальное время одной ступени диализа составило 2 часа, при скорости вращения магнитной мешалки 500 об/мин. Более высокая скорость к уменьшению времени диализа не приводит.

Таким образом, чтобы процесс диализа был максимально эффективным необходимо проводить его в течение 20 часов при постоянном перемешивании приемной жидкости в приемной камере диализатора со скоростью 500 об/мин и сменой приемной жидкости каждые два часа при температуре 4 С.

Полученный после двукратного высаливания раствор разделяли методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ). Препаративное ИЭФ экстракта печени проводили в колонке 8100 LKB (440 мл), на которую наносили до 100 мл раствора, содержащего не более 100мг общего белка. При изоэлектрофокусировании использовали 0,5% раствор амфолинов (LKB, Швеция) с интервалом рН 3,5-10 в градиенте концентрации сахарозы 60-0%. Время изоэлектрофокусирования 48 часов при напряжении 200-600 В и температуре 4С. После проведения ИЭФ собирали фракции по 5 мл, во всех фракциях определяли рН и светопоглощение при 280 нм. Первые девять фракций имели рН<3,5, их объединяли.

Разработка лечебнопрофилактического препарата на основе кислых регуляторных белков печени

При выборе формы введения кислого регуляторного белка печени необходимо было учитывать всю совокупность его химико-фармацевтических свойств и особенности дозировки и прежде всего то, что действующий компонент препарата органоспецифичен, поэтому необходимо обеспечить доставку действующего вещества к «органу мишени»; при этом лекарственное вещество должно легко высвобождаться из таблетированной формы, таблетки должны обладать повышенной остаточной влажностью, а в процессе получения следует исключить повышенное давление и контакт с металлическим оборудованием. Тритурационные таблетки как лекарственная форма достаточно полно соответствуют вышеизложенным требованиям, и в настоящем случае они предназначенны для рассасывания в ротовой полости, что позволяет исключить их покрытие оболочкой, и это в свою очередь делает технологию более экономичной и компактной.

Для разрабатываемых тритурационных таблеток необходимо было выбрать состав вспомогательных веществ.

Исследовались комбинации вспомогательных веществ глюкоза, лактоза, сахароза с увлажнителями – 10% раствор колидона- 25 водный и спиртовой, 3% водный раствор метилцеллюлоза 8 (МЦ – 8), 10% раствор колликута. Для каждой из пластичных масс определяли предельное напряжение сдвига.

Пластичные массы, имеющие более одного максимума напряжения сдвига, не обладают достаточной прочностью вследствие нестабильности. Поскольку количество увлажнителя должно быть максимальным, экстремум графика должен иметь наибольшую абсциссу (рис. 6, рис. 7).

а) б)

Рис. 6. Зависимость напряжения предельного сдвига неразрушенной структуры от концентрации увлажнителя:

а) 10% водный раствор колидон-25, б) 10% спиртовой раствор колидон-25

а) б)

Рис. 7. Зависимость напряжения предельного сдвига неразрушенной структуры от концентрации увлажнителя: а) 3% раствор МЦ-8, б) 10% колликут)

Этим требованиям удовлетворяла только пластичная масса, состоящая из лактозы, где в качестве увлажнителя используется 10% водный раствор колидона-25, вводимый в количестве 18% от массы сухого вещества.

Состав тритурационных таблеток представлен в таблице 3.

Таблица 3

Состав разработанных тритурационных таблеток «Гепотрит»

Наименование сырья

Обозначение НД

Содержание в

1 таблетке, мг

Раствор гликопротеина печени,10-10мг белка/мл

ТУ экспериментальной партии

1,62

Лактоза

ТУ 6-09-2293-79

7,00

Колидон-25

ТУ 42-8482-98

0,16

Ароматизатор сухой «Лимон»

ТУ 9145-001-47929464-98

0,22

итого:

9,00

Стандартизацию тритурационных таблеток проводили по содержанию действующих веществ и физико-химическим показателям в соответствии с фармакопейной статьей «Таблетки».

Определение описания, цвета, вкуса, запаха, и физико-химических показателей таблеток проводили по СТ СЭВ 4710-84. Описание и цвет – по ГФ XI, вып. 2, ст. «Таблетки», с.154, вкус и запах – органолептически.

Распадаемость и среднюю массу тритурационных таблеток определяли согласно ГФ XI, вып. 2, ст. «Таблетки», с.154. При установлении сроков хранения таблетки подвергали исследованию по качественным показателям при хранении в естественных условиях.

Учитывая характер действующего вещества таблеток и его дозировку, определение подлинности проводили модифицированным методом биотестирования на наличие мембранотропного эффекта.

Исследование образца тритурационных таблеток методом биотестирования на наличие специфической активности подтвердило мембранотропный эффект (табл. 4), что свидетельствует о подлинности препарата.

Таблица 4

Результаты биотестирования разработанных тритурационных таблеток

Количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани

Ма*, %

из культуры печени контрольной серии (Nк.)

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»