WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Создание экспериментальных моделей патологических состояний на животных. Моделирование экспериментального токсического гепатита (ЭТГ) осуществляли пероральным введением четыреххлористого углерода (ССl4), являющегося органоспецифичным токсином, обладающим гепатотропным действием. После суточной пищевой депривации животным однократно вводили ССl4 в виде раствора в вазелиновом масле в дозе 0,064 мл на 100 г веса животного. Для создания модели экспериментального гипертиреоза использовали трийодтиронин (BioChemika, Швейцария). После суточной пищевой депривации животным внутрибрюшинно вводили трийодтиронин в дозе 100 мкг на 100 г массы тела в 0,9% NaCl. Инъекции осуществляли трижды в течение 6 дней. На следующий день после индуцирования патологического состояния вводили мелатонин (Sigma, США), внутрибрюшинно (2 мг на кг веса) в течение 3-х дней. При исследовании влияния мелатонина на животных с ЭТГ и экспериментальным гипертиреозом были созданы опытные группы: крысы 1-й группы – содержались на стандартном режиме вивария (контроль; n = 19); 2-я группа – животные с экспериментальной патологией (n = 20); в 3-й группе – интактным животным внутрибрюшинно вводили мелатонин (2 мг на кг веса), ежедневно в течение 3-х дней в утренние часы (n = 18); в 4-й группе – животным с экспериментальной патологией вводили мелатонин (n = 18).

Клиническое исследование больных c лекарственным поражением печени. В клиническое исследование было включено 27 человек с ЛПП, развивающемся вследствие комплексного приема 4-5 противотуберкулезных препаратов (изониазид, пиразинамид, стрептомицин, рифампицин, этамбутол, микобутин). Среди них 23 мужчины (85%) и 4 женщины (15%). Возраст больных составлял от 21 до 75 лет: средний возраст – 44,1±6,1 года. Все пациенты были больны инфильтративным туберкулезом легких. Средняя продолжительность заболевания составляла 3,7±0,3 месяца. Диагноз ЛПП был поставлен на основании клинических признаков заболевания, биохимического исследования крови, данных ультразвукового исследования печени. Из сопутствующих заболеваний регистрировались гипертоническая болезнь – у 18 больных, хронический гастрит в стадии ремиссии – у 16 больных.

Критериями исключения из исследования являлись: вирусные гепатиты, злокачественные новообразования, сахарный диабет, острый инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения.

Больные были поделены на 2 группы. Первая группа пациентов (14 человек) находилась на традиционном лечении гепатопротекторами (эссенциале, карсил). Вторая группа пациентов (13 человек) дополнительно к гепатопротекторам получала эпифамин (ООО «Клиника Института биорегуляции и геронтологии», Санкт-Петербург, Россия; удостоверение качества и безопасности №103, регистрационное удостоверение № 004471.Р.643.04.2003, биологически активная добавка) по 1 таблетке (10 мг) 3 раза в день за 10-15 минут до еды в течение 7 дней.

Клиническое исследование больных с синдромом тиреотоксикоза. В клиническое исследование было включено 23 человека c синдромом тиреотоксикоза, в том числе 5 мужчин (22%) и 18 женщин (78%). Возраст пациентов составлял от 27 до 69 лет: средний возраст – 49,6±3,8 лет. Синдром тиреотоксикоза возникал при диффузном токсическом зобе – 12 пациентов (52%), смешанном токсическом зобе – 4 пациента (17%), узловом токсическом зобе – 4 пациента (17%), хроническом аутоиммунном тиреоидите – 3 пациента (14%). По степени тяжести к субклиническому тиреотоксикозу было отнесено 2 пациента (9%), манифестному – 18 пациентов (78%), осложненному – 3 пациента (13%). Диагнозы были поставлены на основании клинических признаков заболевания, гормонального исследования крови, данных ультразвукового исследования щитовидной железы. Средняя продолжительность заболевания составляла 4,2±0,7 месяца. Из сопутствующих заболеваний наиболее часто встречались гипертоническая болезнь – у 12 больных, хронический гастрит в стадии ремиссии – у 4 больных, хронический криптогенный панкреатит в стадии ремиссии – у 3 больных.

Критериями исключения из исследования являлись: вирусные гепатиты, злокачественные новообразования, сахарный диабет, острый инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения.

Больные были поделены на 2 группы. Первая группа пациентов – 11 человек, находящихся на традиционном лечении (антитиреоидные препараты: мерказолил, тирозол (суточная доза 30-40 мг); -адреноблокаторы: анаприлин, атенолол, метопролол). Вторая группа пациентов – 12 человек, дополнительно к базисной терапии получала эпифамин по 1 таблетке (10 мг) 3 раза в день за 10-15 минут до еды в течение 7 дней.

Подготовка материала для исследования. Печень и сердце у животных извлекали под наркозом после перфузирования физиологическим раствором. Для получения гомогенатов навески печени и сердца крыс гомогенизировали в 4-х кратном объеме охлажденной среды выделения (0,1М трис-НСl-буфер (рН 7,8), содержащий 1мМ ЭДТА и 1% -меркаптоэтанол). Гомогенаты центрифугировали при 10000g в течение 12 мин при t=4С. Сыворотку получали из венозной крови стандартными методами.

Оценка интенсивности свобнорадикального окисления. Для оценки оксидативного статуса определяли содержание диеновых коньюгатов (ДК) спектрофотометрическим методом при 233 нм (Стальная И.Д., 1977). Для определения интенсивности СРО применяли также метод биохемилюминесценции (БХЛ), с использованием биохемилюминометра БХЛ-06М с программным обеспечением (Любицкий О.Б., 1996).

Оценка активности ферментов. Активность ферментов определяли на спектрофотометре СФ-56 с программным обеспечением. О скорости ферментативных реакций судили по изменению оптической плотности при 340 нм (глутатионпероксидаза (ГП), глутатионредуктаза (ГР), НАДФ-ИДГ, Г6ФДГ). Активность АГ определяли при 235 нм, каталазы – при 410 нм. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли на хемилюминометре ХЛМ 1Ц-01 с приставкой (Пашков А.Н., 1992). Активность ферментов выражали в ферментативных единицах в расчете на грамм сырой массы (для тканевых гомогенатов) или на мл сыворотки, а также в виде удельной активности (в расчете на мг белка). Различные способы представления ферментативной активности позволяли наиболее адекватно оценить наблюдающиеся модификации функционирования ферментов, так как при развитии исследуемых патологических состояний происходили изменения содержания общего белка в тканях. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта реакции за 1 мин при температуре 25°С. Для определения активностей аспартатаминотрансферазы (АсАт), аланинаминотрансферазы (АлАт) и креатинкиназы-МВ (КК-МВ) использовали стандартный набор реактивов Био-Ла-Тест. Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Lowry O.H., 1951).

Определение содержания компонентов неферментативной антиоксидантной системы. Содержание восстановленного глутатиона (GSH) определяли с помощью реакции, в результате которой образуется тионитрофенильный анион, имеющий максимум поглощения при 412 нм. Количество цитрата определяли по методу Нательсона (Медведева Л.В. и др., 2002). Определение содержания -токоферола проводили с помощью фотометрирования хромогенного комплексного соединения Fe2+, образующегося при взаимодействии -токоферола с FeCl3, и ортофенотролина (Desai I.D. et al, 1986).

Общие, клинические и инструментальные методы исследования. Измерения АД, регистрацию ЭКГ, определение размеров и относительной тупости сердца, оценку пульса, пальпацию печени осуществляли стандартными методами (Мухин Н.А. и др., 2003). Показатели общего анализа крови определяли на приборе «Coulter ACT diff». Параметры биохимического анализа крови исследовали на приборе «Кlima 15MC». Степень компенсации тиреотоксикоза оценивали по уровню тиреоидных гормонов: тиреотропного гормона (ТТГ), тироксина (Т4) свободного, определяемого на ИФА «Униплан». При физикальном обследовании пациентов с ЛПП и синдромом тиреотоксикоза оценивали основные объективные признаки заболеваний, а также психо-эмоциональное состояние пациентов. Размеры и структура щитовидной железы и печени исследовались с помощью УЗИ на приборах «Aloka SSD-500» и «Sonos 1000».

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка материала включала в себя использование стандартных методов вариационной статистики (расчет средних значений (М), ошибка средних значений (m), t-критерия Стъюдента) и непараметрического теста Вилкоксона c использованием прикладных программ “STATISTICA 6.0”. Достоверными считались различия при р0,05.

ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕЛАТОНИНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ГИПЕРТИРЕОЗЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЖИВОТНЫХ

Влияние мелатонина на интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях крыс при токсическом гепатите и гипертиреозе

На 4-й день после введения ССl4 животным активности АлАТ и АсАТ в сыворотке крови возрастали в 7,4 и 4,3 раза (p<0,01), что свидетельствовало о развитии патологического процесса. При введении мелатонина при развитии ЭТГ наблюдалось снижение активности АлАТ в 2,5 раза (p<0,01), АсАТ – в 1,5 раза (p<0,05). Активности маркерных ферментов (АлАт, АсАт и КК-МВ), повышающиеся при гипертиреозе, также уменьшались на фоне действия мелатонина.

При ЭТГ уровень первичных продуктов ПОЛ – диеновых коньюгатов (ДК), в сыворотке крови и печени крыс возрастал в 2,1 (p<0,01) и 1,8 (p<0,05) раза по сравнению с интактными животными. При действии мелатонина при ЭТГ уровень ДК изменялся в сторону нормы. При гипертиреозе также наблюдалось накопление ДК в крови, печени и сердце по сравнению с контрольной группой и снижение их содержания при введении мелатонина. При ЭТГ параметры БХЛ – светосумма хемилюминесценции (S) и интенсивность максимальной вспышки (Imax), отражающие интенсивность СРО, возрастали в сыворотке крови в 2,1 (p<0,05) и 2,3 (p<0,01) раза, в печени в 2,2 раза (p<0,05), соответственно. Величина тангенса угла наклона кинетической кривой (tg2), являющаяся показателем общей антиоксидантной активности, увеличивалась в 4,0 (p<0,01) раза в сыворотке и в 3,0 (p<0,01) раза в печени что, очевидно, связано с мобилизацией АОС в ответ на инициацию СРО. При введении мелатонина при ЭТГ исследуемые параметры изменялись в сторону нормы. S и Imax, возрастали при экспериментальном гипертиреозе в сыворотке крови в 1,5 (p<0,05) и 1,2 раза, в печени – в 1,3 и 1,4 (p<0,05) раза, в сердце – в 1,4 и 1,8 (p<0,05) раза, соответственно. Величина tg2 была выше в сыворотке крови в 2,2 (p<0,01) раза, в печени – в 1,2 раза, чем соответствующий параметр в условиях нормы. Однако в сердце величина tg2 возрастала только на 10%. Введение мелатонина на фоне развития экспериментального гипертиреоза также приводило к снижению S, Imax и tg2 в сторону нормы. Снижение уровня СРО, очевидно, было обусловлено антиоксидантным действием мелатонина.

При ЭТГ происходило падение удельной активности АГ в сыворотке крови и

А

Б

Рис.1. Удельная активность аконитатгидратазы в сыворотке крови крыс при токсическом гепатите (А) и экспериментальном гипертиреозе (Б) в норме (1), патологическом состоянии (2) и действии мелатонина в норме (3) и при патологии (4).

в печени в 2,4 (p<0,01) и 3,0 (p<0,01) раза соответственно по сравнению с контрольным уровнем (рис. 1А). Согласно современным представлениям АГ является критической мишенью действия АФК и чувствительным критерием развития оксидативного стресса. АФК, образующиеся в большом количестве в условиях интенсификации СРО, приводят к разрушению важного для каталитической активности Fe-S-кластера АГ (Skulachev V.P., 1996). После введения мелатонина крысам с ЭТГ происходило возрастание удельной активности фермента в сыворотке крови в 2,4 раза (p<0,01), в печени в 1,4 раза (p<0,05). Нами установлено, что при экспериментальном гипертиреозе также наблюдалось уменьшение активности АГ в тканях печени, сердца и крови, экзогенный мелатонин увеличивал ферментативную активность (Рис. 1Б). По-видимому, степень повреждения молекулы фермента свободными радикалами уменьшалась под действием мелатонина.

Активность ферментативного звена антиоксидантной системы и ферментов окислительного метаболизма в тканях экспериментальных животных при токсическом гепатите и гипертиреозе

При ЭТГ удельная активность ГР в сыворотке крови повышалась в 1,9 раза (p<0,05) по сравнению с нормой. Активность ГП в сыворотке также имела тенденцию к повышению. В печени удельная активность ГП возрастала более чем в 3 раза (p<0,01), а ГР – в 2 раза (p<0,01). При введении мелатонина животным на фоне развития ЭТГ происходило уменьшение активностей ГП и ГР как в сыворотке крови, так и в печени. Повышение активности ГП-ГР системы наблюдалось и при гипертиреозе. При введении мелатонина при развитии гипертиреоза происходило снижение активностей ГП и ГР. Это, вероятно, было связано с уменьшением функциональной нагрузки на ГП-ГР систему в результате антиоксидантного эффекта мелатонина.

Поставщиками НАДФН для ГП-ГР системы служат Г6ФДГ – ключевой фермент пентозофосфатного пути, и реакция, катализируемая НАДФ-ИДГ. При ЭТГ удельные активности НАДФ-ИДГ и Г6ФДГ в сыворотке крови возрастали в 3,0 (p<0,01) и 2,0 (p<0,01) раза соответственно (Рис. 2). Удельные активности НАДФ-ИДГ и Г6ФДГ в печени увеличивались в 1,4 (p<0,05) и 1,5 (p<0,05) раза по сравнению с интактными животными. Удельная активность НАДФ-ИДГ в сыворотке крови у животных 4-й группы падала в 1,6 (p<0,05) по сравнению с ферментативной

А

Б

Рис.2. Удельные активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (А) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Б) в сыворотке крови крыс в норме (1), при токсическом гепатите (2) и действии мелатонина в норме (3) и при гепатите (4).

активностью во 2-й опытной группе. Однако активность Г6ФДГ практически не изменялась. Происходило уменьшение активностей НАДФ-ИДГ и Г6ФДГ в печени животных.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»