WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Для заживления перфорации барабанной перепонки применялись следующие методы лечения: 1-я группа - 87 пациентов. Этим больным на перфорированную барабанную перепонку осуществлена трансплантация культивированных аллофибробластов человека, с фиксацией современной интерактивной повязкой Tampograss. 2-я группа - 51 пациент, которым на перфорированную барабанную перепонку осуществлена трансплантация куриного амниона. 3-я группа - 59 больных. Этим больным, для объективной оценки результатов исследования на перфорированную барабанную перепонку укладывалась только синтетическая подложка с коллагеном без аллофибробластов (рис.1).

Рис. 1

При исследовании заживления трепанационной раны височной кости 17 пациентам 1 клинической группы по мере развития грануляционной ткани после операции трансплантировали культуру аллофибробластов человека. 16 пациентам 2 клинической группы в послеоперационную полость, для объективной оценки результатов исследования вводилась только синтетическая подложка с коллагеном без аллофибробластов (рис.2).

Рис. 2

У больных с ранами лицевой области применялись следующие методы лечения: 1-я группа - 15 пациентов. Этим больным на рану лицевой области осуществлена трансплантация культивированных аллофибробластов человека, с фиксацией современной интерактивной повязки Grasolind в 1 и 2 фазу раневого процесса. 2-я группа - 12 пациентов, которым проводилось традиционное лечение – использование 3% перекиси водорода, марлевых повязок с мазью левомиколь. У этих пациентов мы наблюдали за возможностью самовосстановления эпидермального слоя без дополнительного хирургического лечения. 3-я группа - 11 больных. Этим больным, для объективной оценки результатов исследования на рану укладывалась только синтетическая подложка с коллагеном без аллофибробластов (рис.3).

Рис. 3

Во всех группах были представлены пациенты различного возраста, пола, с различной локализацией, глубиной и размером раны. возникшие в результате разных механизмов, отличающиеся по локализации и размеру.

Больные всех групп находились на динамическом наблюдении. Особое внимание уделялось морфологической и цитологической оценке ран в ходе лечения. Морфологическое исследование включало изучение клеток раневой поверхности методом мазков-отпечатков и исследование биоптатов ран.

Цитологическое исследование производили периодически в соответствии с этапами лечения и заживления ран: до трансплантации культивированных аллофибробластов человека, после снятия пленочных матриксов, на которых переносились клеточные культуры, в процессе заживления раны на 2-е 4-е 7-е сутки после трансплантации аллофибробластов в сравнении с участками, где не выполнялась трансплантация аллофибробластов.

Исследуемые раны пациентов подвергались фото- и видеосъемке. Больным проводись следующие общеклинические исследования: общий клинический анализ крови; RW и ВИЧ; группа крови, RH; рентгенография костей свода черепа. Больные консультированы по показаниям терапевтом, стоматологом, нейрохирургом, окулистом. В группе больных с поражением звукопроводящей системы осуществлялся аудиологический контроль как до, так и во время и после лечения на протяжении 20 месяцев. Специальное обследование включало в себя следующее: отоскопию; микроотоскопию с использованием воронки Зигле и операци­онного микроскопа фирмы "Karl Zeiss"; зондирование барабанной полости, аттика, aditus ad antrum, задней стенки наружного слухового прохода; исследование проходимости слуховой трубы; исследования вентиляционной функции слуховой трубы. Рентгенологическое исследование - в проекциях Шюллера, Майера, а при показаниях - в проекции Стенверса. Для выяснения функции слухового анализатора использовали следующие методы: определение расстояния восприятия шепотной и разговорной речи; камертональное исследова­ния в форме опытов Ринне, Вебера, и Швабаха камертонами С128, С250; тональную пороговую аудиометрию. Исследование функции слухового анализатора проводились акуметрически и аудиометрически в звукоизолированной камере фо­нового шума менее 30 дБ. Пороговую аудиометрию проводили на приборе МА-31. Диапазон исследуемых частот при по­роговой аудиометрии при воздушном звукопроведении включал час­тоты от 125 Гц до 10000 Гц, при костном звукопроведении включал частоты от 125 Гц до 8000 Гц. Тимпанометрию производили на импедансометре ZA-27 (Дания) при частоте зондирующего тона 220 Гц. Исследование проводилось через 1,5-3-6-12 месяцев после операции.

Расчет статистических значений, критерия Стьюдента, доверительных интервалов для зависимых и независимых выборок по различным группам обследованных проводили на ЭВМ методами вариационной статистики с помощью пакета прикладных биометрических программ. В табличных данных представлено, в основном, сравнение полученных значений зависимых и независимых выборок, частоты возникновения положительных морфологических результатов для Р < 0,05.

При поиске новых методов оптимального лечения вышеперечисленных ран встречающихся в оториноларингологии наше внимание остановилось на работе по культивированию аллофибробластов, которые с успехом применяются при лечении больных с ожоговыми ранами. Уникальные свойства и возможности культивируемых аллофибробластов по регенерации тканей, давали надежду на успешное внедрение их в оториноларингологическую практику, в том числе и в условиях нашего исследования.

Метод культивирования трансплантата из аллофибробластов человека.

Для получения первичной культуры фибробластов используются фрагменты расщепленного кожного лоскута, полученные от больных во время операции дермопластики, а также из дермы плодов человека. Следует отметить большую эффективность трансплантации при использовании фибробластов из дермы плодов человека, которые обладают высокой пролиферативной способностью. Перед началом культивирования обязательно проводится их бактериологическое и вирусологическое тестирование – ставится реакция Вассермана, определяется наличие антител к вирусам гепатита и СПИДа.

Забор материала осуществляется стерильно, после чего он помещается среду ИГЛа, содержащую 1000 ед./мл пенициллина, 0,1 г/мл стрептомицина и 25 мкг/мл фунгезона, и доставляется в лабораторию. Первичную культуру фибробластов получают методом органного культивирования. Культивирование фибробластов на всех этапах ведется в среде ИГЛа (Институт полиомиелита РАМН) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2% глютамина CO2-инкубаторе (Flow, Великобритания) на пластмассовой посуде фирмы «Costar” (США). Смена среды осуществляется каждые 3-5 дней. После получения островкового роста, культура клеток подвергается пассированию, для чего используется трипсин-EDITA (Flow, Великобритания). Плотность посева клеток при получении культуры и клеток фибробластов человека составляет 20х103 см2 поверхности и остается постоянной на всех этапах.

Основные этапы методики получения трансплантата из культивируемых аллофибробластов человека представлены на рис.4

Основные этапы получения трансплантата культивируемых аллофибробластов

ФРАГМЕНТ ДЕРМАЛЬНОГО ЛОСКУТА

ФРАГМЕНТАЦИЯ

ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА ФИБРОБЛАСТОВ

микробиологический контроль морфологический контроль

ПАССИРОВАНИЕ
СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ ФИБРОБЛАСТОВ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОК НА РАНУ

Рис. 4

Морфологическая характеристика трансплантируемых фибробластов.

Динамическая морфофункциональная оценка культур фибробластов показывает, что через 2 часа после начала субкультивирования, культура фибробластов состоит в основном из округлых клеток, интенсивно окрашиваемых толуидиновым синим.

При электронной микроскопии основной тип клеток через 2 часа после начала культивирования представлен небольшими округлыми, реже овальной формы фибробластами. Ядро таких клеток характеризуется округлой формой и занимает почти весь объем клетки. К исходу первых суток культивирования изменяется соотношение типов клеток культуры, на этом этапе преобладают клетки веретеновидной формы с хорошо дифференцируемым ядром. К исходу первых суток развития культуры в фибробластах происходит накопление фибронектина, также отмечается преобладание клеток веретеновидной и звездчатой формы, в которых цитоплазма занимает больший объем клетки. На третьи сутки культивирования плотность посева уже составляет не менее 20000 клеток на 1 см2 поверхности, культура фибробластов характеризуется конфлюэнтным ростом. Практически все клетки культуры представлены веретеновидными или звездчатыми формами. К концу третьих суток большинство клеток характеризуется вытянутой формой, меньшим по сравнению с предыдущими сроками наблюдения, объемом цитоплазмы. Пластинчатый комплекс клеток выглядит значительно редуцированным. Экстрацеллюлярный матрикс становится еще более насыщенным хлопьевидным материалом и коллагеновыми микрофибриллами и волокнами. Таким образом, структурно-функциональный анализ культуры фибробластов человека на этапе четвертого субкультивирования показывает их динамику, и обуславливает то, что наиболее благоприятными сроками использования культуры аллофибробластов для изготовления трансплантатов являются третьи сутки культивирования.


Методика трансплантации культивированных аллофибробластов человека

поперечный разрез трансплантата

монослой аллофибробластов

монослой коллагена

полимерная пленка

толщиной 0,1 мм

Рис. 5

  • Культура аллофибробластов нанесена на тонкую, прозрачную полимерную пленку. Это обстоятельство позволяет варьировать размерами трансплантата и доставлять клетки непосредственно к ране.
  • Фибробласты фиксируются на пленку за счет монослоя коллагена, обладающего хорошим адгезивным эффектом. Это позволяет обеспечить стабильную позицию трансплантата на ране без использования клеевых композиций.
  • Непосредственный контакт фибробластов с питающим ложем обеспечивается за счет гранулирующей поверхности раны или деэпителизированного участка барабанной перепонки.

Фибробласты нанесены с обеих сторон полимерной пленки, что позволяет укладывать пленку любой стороной к ране, барабанной перепонке.

Методика трансплантации культивированных аллофибробластов человека на перфорированную барабанную перепонку

Трансплантацию фибробластов выполняли следующим образом: анестезировали слуховой проход и барабанную перепонку 1% раствором ультрокаина в типичных точках. Затем иссекали рубцово-измененные края перфорации БП, деэпидермизировали ее наружную поверхность по окружности перфорации на расстоянии до 5 мм от краев последней или субтотально. Зона деэпителизации зависела от состояния перепонки, размера перфорации, наличия сосудов, механизма образования перфорации. Вырезали кусочек пленки с фибробластами по форме приближающийся к очертаниям перфорации, превышающий размеры дефекта БП. Трансплантат плотно фиксировали к БП так, чтобы он несколько вдавался в просвет перфорации. При этом большая часть трансплантата находилась на поверхности неповрежденной БП, а часть закрывала перфорацию. Благодаря пленке на перфорации слух улучшался во время операции, а за счет пленки с клетками, плотно прилегающей к деэпителизированному слою, происходила трансплантация фибробластов на края перфорации. Пленку с фибробластами фиксировали современной интерактивной повязкой Tampograss (Paul Hartman). Тампон удаляли на 3 сутки после трансплантации клеток. Полимерную пленку-носитель, на которую были нанесены аллофибробласты, не удаляли (рис. 6-8)

Трансплантация аллофибробластов на перфорированную барабанную перепонку

Рисунок 6. Перфорация барабанной перепонки

Рисунок 7. Деэпителизация наружного слоя барабанной перепонки

турунда tampogrss

Рисунок 8 Трансплантация аллофибробластов на синтетической подложке, с последующей тампонадой слух. прохода турундой Tampograss




Методика трансплантации культивированных аллофибробластов человека на рану лицевой области

Культуру аллофибробластов человека получали в институте хирургии им. А.В. Вишневского РАМН. Культура клеток выращивалась в лаборатории культивирования тканей по отработанной методике. Срок выращивания монослойной культуры составлял 3-е суток. Трансплантаты культивированных аллофибробластов доставляли в клинику в день операции. Перевозка клеток осуществлялась на мембране (матриксе), помещенной в пластиковые чашки Петри со средой ИГЛа.

Трансплантация на раневую поверхность культивированных аллофибробластов человека осуществлялась на этих же матриксах и выполнялась в условиях операционной. Матриксы с культивированными аллофибробластами извлекали из чашек Петри пинцетом и накладывали на раневую поверхность. При этом матриксы плотно располагали один к другому. Раневую поверхность после наложения синтетических матриксов с аллофибробластами закрывали интерактивной повязкой Grasolind (Paul Hartman) и лейкопластырем.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»