WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

В результате сканирования и обсчета радиоавтографов оказалось, что ДЭНА, в отличие от 3'-МеДАБ, снижает активность HNF3 при добавлении во фракцию I (Рис. 2). Следовательно, для видонеспецифичного ДЭНА посредник не нужен, поскольку фракция I не содержит этого белка, необходимого для действия 3’МеДАБ. Прямо или опосредованно ДЭНА осуществляет свое действие на HNF3 остается неизвестным, однако полученные нами данные показывают, что видонеспецифичный гепатоканцероген ДЭНА реализует иной механизм воздействия на ДНК связывающую активность HNF3, чем видоспецифичные ОАТ и 3'-МеДАБ.

Влияние ОАТ, 3МеДАБ и ДЭНА на рецепторы ксенобиотиков PPAR, CAR, PXR, LXR, AhR. Представлялось наиболее вероятным, что белок-посредник в действии гепатоканцерогенных аминоазокрасителей может относиться к рецепторам ксенобиотиков. Известно, что эти рецепторы связывают широкий круг соединений различной структуры и участвуют во множестве регуляторных процессов, включая регуляцию клеточного цикла и индукцию опухолей. Поэтому было изучено действие ОАТ и 3’МеДАБ на ДНК-связывающую активность PPAR, CAR, PXR, LXR, AhR методом задержки в геле олигонуклеотидов, соответствующих их специфическим сайтам связывания. Видно (Рис. 3), что под действием и ОАТ и 3’МеДАБ происходит увеличение активности практически всех рецепторов, за исключением PPAR. Однако нас интересовал рецептор, который обнаружил бы избирательность в активации видоспецифическими канцерогенами, и такую избирательность в активации проявили два рецептора - конститутивный рецептор андростанов и арилгидрокарбоновый рецептор.

Рис. 3. ДНК-связывающая активность CAR, Ah-рецептора (AhR), PXR, LXR, PPAR, Ets в суммарной фракции экстракта ядер печени мышей (А) и крыс (Б) в контроле и после введения животным азокрасителей.

Представлены типичные результаты одного из 5 экспериментов (мыши) и 4 экспериментов (крысы). В каждый эксперимент брали по 1 крысе и 2 мыши.

Рис. 4. Изменение ДНК-связывающей активности арилгидрокарбонового рецептора (AhR) и конститутивного рецептора андростанов (CAR) в суммарной фракции ядер печени мышей и крыс под действием ОАТ и 3’МеДАБ в относительных единицах по результатам количественной денситометрии радиоавтографов (Рис. 3), за единицу принята интенсивность сигнала в полосе задержки при инкубации с экстрактом ядер печени животных контрольной группы. В скобках указано число экспериментов. В каждый эксперимент брали по две мыши или по одной крысе. * - достоверность отличий данных “3’МеДАБ” и “ОАТ” составила 95%, при использовании t-критерия Стьюдента.

Результаты количественной обработки радиоавтографов экспериментов по задержке в геле (Рис. 4) показывают, что в ответ на ОАТ у мышей активность AhR увеличивалась в 6,3 раза, а CAR - в 3 раза по сравнению с их исходным уровнем, тогда как в ответ на неканцерогенный для этих животных 3’МеДАБ всего лишь в 2 раза. В печени крыс в ответ на гепатоканцерогенный для них 3’МеДАБ активность AhR увеличивалась в 6,3 раза, а CAR - в 3 раза по сравнению с их исходным уровнем, тогда как в ответ на неканцерогенный ОАТ для этих животных активность AhR всего лишь в 2 раза, CAR – недостоверно изменялась.

Для идентификации ДНК-связывающей активности AhR и CAR были использованы специфические антитела к AhR и CAR. Добавление антител к CAR приводило к исчезновению полосы, соответствующей комплексу белок-зонд, добавление разных препаратов антител к AhR приводило либо к исчезновению соответствующих полос, либо к их супершифту т.е. комплекс АТ-ТФ-зонд демонстрирует меньшую подвижность, чем в отсутствии антител.

Рис. 5. Идентификация белков с помощью антител (АТ) в ДНК-белковых комплексах, образованных белками ядерного экстракта и ДНК-зондами CAR (А) и AhR (Б). Экстракты ядер прединкубированы в присутствии антител и при добавлении 1% желатина. Использовали АТ к CAR (SantaCruz Biotech. Inc., USA), в случае мышей использовали АТ к AhR (SantaCruz Biotech. Inc., USA), а в случае крыс – АТ к AhR (AbCam, USA).

Введение ДЭНА, вызывающего развитие опухолей и у крыс и у мышей, также сопровождается снижением активности HNF3, также как и введение видоспецифических аминоазокрасителей [Меркулова и др., 2003]. Однако, как мы показали, механизм действия ДЭНА не требует присутствия белка-посредника (Рис. 2). Поэтому можно было предполагать, что если один из рецепторов - потенциальный посредник, обеспечивающий видоспецифичность действия азокрасителей, то он не должен активироваться ДЭНА.

Рис. 6. ДНК-связывающая активность CAR, AhR и Ets в экстрактах ядер печени мышей A/He в контроле и при введении ОАТ и ДЭНА.

Приведен типичный радиоавтограф одного из 3 независимых экспериментов.

Оказалось, что в ответ на ДЭНА (Рис. 6) активации CAR и AhR не наблюдается. Эти результаты хорошо сочетаются с данными о том (Рис. 2), что механизм действия ДЭНА не включает активации белка-посредника, необходимого для действия ОАТ и 3’МеДАБ.

ДНК-связывающая активность белка определяется как количеством молекул этого белка, так и их состоянием. Поэтому была проведена оценка влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на содержание белков AhR, CAR методом Вестерн-блот-гибридизации (Рис. 7).

Рис. 7. Вестерн-блот-гибридизация с антителами к AhR и CAR экстрактов ядер клеток печени мышей и крыс до и после обработки аминоазокрасителями ОАТ и 3’МеДАБ.

Приведен типичный результат одного из 3 независимых экспериментов. Параллельно оценивали содержание белка -актина.

Согласно ранее полученным данным ДНК-связывающая активность AhR и CAR под действием специфичного для данного вида гепатоканцерогена увеличивалась в 5-6 раз и в 3 раза соответственно (Рис. 5). По результатам Вестерн-блот-гибридизации таких многократных изменений содержания CAR и AhR после обработки гепатоканцерогенами не выявлено (Рис. 8). Следовательно, наблюдаемый эффект увеличения ДНК-связывающей активности CAR и AhR под действием ОАТ и 3’МеДАБ не объясняется изменением содержания этих белков в ядерных экстрактах. По-видимому, это происходит за счет изменения их состояния, например, в результате связывания ОАТ и 3’МеДАБ. Известно, что аминоазокрасители являются активаторами AhR человека [Kato et al., 2002], крыс и мышей [Mikhailova et al., 2005; Yang M et al., 1997], что позволяет предполагать, что ОАТ и 3’МеДАБ могут выступать в роли лигандов AhR. Также нельзя исключить и CAR из числа регуляторных белков, связывающих эти соединения.

Изучение связывания гепатоканцерогенных аминоазокрасителей с CAR. Для изучения способности ОАТ и 3’МеДАБ специфически взаимодействовать с конститутивным рецептором андростанов были проведены эксперименты по конкуренции этих канцерогенов с известным лигандом CAR андростенолом (5-андрост-16-ен-3-ол) [Forman et al., 1998, Vincent et al., 2005] за связывание с белками цитозоля печени мышей и крыс (Рис.9).

Рис. 9. Связывание 50 мкМ [3Н] – андростенола с цитозолем печени крыс (А) и мышей (Б) в присутствии 25-200(250) кратных избытков немеченого андростенола (кривая 1), 3’МеДАБ (кривая 3), ОАТ (кривая 2), клофибрата (кривая 4), прогестерона (кривая 5).

Представлены результаты 3-5 независимых экспериментов. * - разница значений “3’МеДАБ” и “ОАТ” составила 95%.

В качестве негативного контроля были выбраны прогестерон и клофибрат (высокоспецифичный лиганд для PPAR), которые не конкурировали с андростенолом (Рис. 9). Достоверные результаты по конкуренции ОАТ и 3’МеДАБ были получены при использовании этих веществ в 50-200 кратном избытке по сравнению с меченым андростенолом. Соответствующие этим избыткам концентрации находятся в диапазоне доз, в которых эти вещества вызывают развитие опухолей печени при введении животным (1 мМ), и доз, которые были использованы в экспериментах in vitro по оценке влияния гепатоканцерогенов на ДНК-связывающую активность HNF3 (0,1 мМ) [Каледин и Захарова, 1984; Меркулова и др., 2003]. Этот результат свидетельствует о том, что аминоазокрасители являются низкоаффинными лигандами CAR. Важно отметить тот факт, что в цитозоле печени крыс 3’МеДАБ конкурировал с [3Н]-андростенолом сильнее чем ОАТ, и обратная картина наблюдалась в экспериментах с цитозолем печени мышей – ОАТ сильнее конкурировал, чем 3’МеДАБ (Рис. 9). Таким образом, присутствующий в цитозоле печени мышей и крыс белок лучше связывал «свой» канцероген (ОАТ для мышей и 3’МеДАБ для крыс), чем «чужой» канцероген (3’МеДАБ для мышей и ОАТ для крыс). Эти результаты полностью соответствуют различиям в активации CAR под действием аминоазокрасителей (у мышей ОАТ сильнее увеличивает ДНК-связывающую активность CAR, а у крыс - 3’МеДАБ (Рис. 5)). Итак, вероятно гепатоканцерогенные аминоазокрасители могут связываться с CAR, но с различной эффективностью в зависимости от происхождения белка.

В заключение важно отметить, что получены факты, убедительно свидетельствующие о том, что роль белка, который необходим для угнетения функции HNF3 под влиянием гепатоканцерогенных ОАТ и 3’МеДАБ способны выполнять рецепторы ксенобиотиков CAR и AhR. Во-первых, CAR и AhR активируются избирательным образом под действием аминоазокрасителей: у мышей, чувствительных к гепатоканцерогенному действию ОАТ - строго под действием гепатоканцерогенного ОАТ, но не 3’МеДАБ; а у крыс – под действием 3’МеДАБ, но не ОАТ. Во-вторых, мы показали, что ОАТ и 3'МеДАБ способны конкурировать с лигандом CAR – андростенолом, и, по-видимому, являться его низкоаффинными лигандами. Из данных литературы известно, что ОАТ и 3'МеДАБ активируют экспрессию генов-мишеней AhR, и, по-видимому, являются лигандами AhR. Кроме того, нами показано, что неспецифический гепатоканцероген ДЭНА, который снижает активность HNF3 без участия белка-посредника, также и не активирует AhR и CAR. Оба эти рецептора связывают широкий круг химических веществ и участвуют в регуляции многих процессов в организме млекопитающих, в том числе дифференцировки клеток и клеточного роста, индукции ферментов системы детоксикации ксенобиотиков [Carlson&Perdew, 2002; Barouki et al., 2007]. Возможно, именно эти белки играют ключевую роль в распознавании аминоазокрасителей и обеспечении их видоспецифических гепатоканцерогенных эффектов. Детали механизма передачи сигнала от AhR и CAR на HNF3 пока неизвестны, возможно, что AhR и CAR взаимодействуют с каким-либо белком, который также связывается с HNF3 и приводит к снижению его ДНК-связывающих свойств. Известно также, что рецепторы AhR и CAR активируют ряд протеинкиназ, фосфатаз, которые могут оказывать модифицирующее воздействие на HNF3, меняя его ДНК-связывающие свойства. Какой из этих механизмов вовлечен в передачу сигнала от CAR AhR на HNF3, пока не ясно.

Выводы

  1. Показано, что белок(-ки)-посредник(ки) действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на транскрипционные факторы HNF3 одинаково снижают ДНК-связывающую активность HNF3 мыши и HNF3 крысы. Видоспецифичность действия этих соединений обусловлена избирательной активацией белка(-ов)-посредника(-ов) у крыс под действием гепатоканцерогенного для них 3’МеДАБ, а у мышей - гепатоканцерогенного для них ОАТ.
  2. Выявлена связь между избирательной активацией рецепторов ксенобиотиков AhR и СAR и снижением HNF3 ДНК-связывающей активности под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей, что наблюдается только у чувствительных к этим соединениям животных (под действием ОАТ у мышей, и под действием 3’МеДАБ у крыс).
  3. Показано, что видонеспецифичный гепатоканцероген ДЭНА снижает ДНК-связывающую активность HNF3 по иному механизму, чем видоспецифичные ОАТ и 3'-МеДАБ, не включающему белка-посредника. В ответ на ДЭНА активации CAR и AhR не происходит.
  4. Установлено, что увеличение ДНК-связывающей активности CAR и AhR под действием ОАТ и 3’МеДАБ не вызвано увеличением содержания этих белков в ядрах клеток печени.
  5. Показано, что ОАТ и 3'-МеДАБ конкурируют с [3Н]-андростенолом (известным лигандом CAR) за связывание с белками цитозоля клеток печени. При этом 3’МеДАБ конкурирует за связывание с белками цитозоля печени крыс лучше, чем ОАТ, а ОАТ является более сильным конкурентом, чем 3’МеДАБ в цитозоле печени мышей.
  6. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что AhR и СAR могут выполнять роль белков, опосредующих действие гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на HNF3.

Основные результаты работы содержатся в следующих публикациях:

  1. М.Ю. Пахарукова, М.А. Сметанина, В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, И.В. Романова, Т.И. Меркулова. Активация конститутивного рецептора андростанов под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей в печени мышей и крыс// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Т. 144. 2007. № 9. С. 313-316.
  2. М.Ю. Пахарукова, М.А. Сметанина, В.И. Каледин, И.В. Романова, Т.И. Меркулова. Изучение роли ядерных рецепторов и Ah-рецептора в механизме действия гепатоканцерогенных азокрасителей// Цитология. Т. 49. 2007. №9. С. 781-782.
  3. Merkulova T.I., Kropachev K.Y., Timofeeva O.A., Vasiliev G.V., Levashova Z.V., Ilnitskaya S.I., Kobzev V.F., Pakharukova M.Y., Bryzgalov L.O., Kaledin V.I. Species-specific effects of hepatocarcinogens 3'-methyl-4-dimethyl-aminoazobenzene and ortho-aminoazotoluene in mouse and rat liver// Mol. Carcinogenesis. 44. 2005. № 4. Р. 223-232.
  4. К.Ю. Кропачев, М.Ю. Пахарукова, Л.О. Брызгалов, В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И. Меркулова. Неизвестный ядерный белок, снижающий активность HNF3, обеспечивает видоспецифичность действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей// Доклады Академии Наук. Т. 397. 2004. № 5. С. 694-696.
  5. T.I. Merkulova, V.I. Kaledin, K.Yu. Kropachev, G.V. Vasiliev, V.F. Kobzev, M.Yu. Pakharukova, L.O. Bryzgalov// Abstract book and programme of International conference «Chemical and biological problems of Proteomics». Novosibirsk. Russia.
    Pages:     | 1 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»