WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |

На правах рукописи

УДК: (616.006:577.171.55:577.218)

Пахарукова Мария Юрьевна

Изучение роли транскрипционных факторов HNF3

и рецепторов ксенобиотиков в механизме

видовой специфичности действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей

(03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2008

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Т.И. Меркулова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук А.Ю. Гришанова

кандидат биологических наук Н.С. Логвиненко

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Защита диссертации состоится «___» _____________2008г. На утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___» _____________2008г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук (А.Д. Груздев)

Актуальность работы. Выяснение механизмов химического канцерогенеза является одной из серьезных фундаментальных проблем теоретической онкологии и молекулярной патофизиологии. Несмотря на почти столетнюю историю исследований, до настоящего времени не имеют объяснения многие особенности действия химических канцерогенов, такие как видовая, линейная и тканевая специфичность, отсутствие соответствия между канцерогенной и мутагенной активностью многих химических соединений, обратимость ранних стадий канцерогенеза. Выяснение причин этих явлений имеет большое значение как для понимания механизма канцерогенного процесса, так и для выявления новых кандидатных генов, ответственных за формирование фенотипа, чувствительного или устойчивого к развитию злокачественных опухолей под действием определенных химических веществ.

Ранее при исследовании механизмов видовой специфичности действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей 3’-метил-N,N-диметил-4-аминоазобензола (3’-МеДАБ) и 2’-3-диметил-4-аминоазобензола (орто-аминоазотолуол, ОАТ) была выявлена связь между опухолеиндуцирующим эффектом соединения и снижением ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов HNF3 (hepatocyte nuclear factor), играющих важную роль в процессах дифференцировки и торможения пролиферации гепатоцитов. Было показано, что снижение ДНК-связывающей активности HNF3 в печени крыс происходит в ответ на введение специфичного для крыс гепатоканцерогена 3'-МеДАБ, но не канцерогенного для мышей ОАТ, и, наоборот, в печени мышей активность HNF3 снижается при введении специфичного для мышей гепатоканцерогена ОАТ, но не 3'-МеДАБ, причем это имеет место только у чувствительных к опухолеиндуцирующему действию ОАТ линий [Меркулова и др., 1998; Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003]. Однако, каким образом обеспечивается такая избирательность, остается неясным. Дальнейшие исследования показали, что влияние ОАТ и 3'-МеДАБ на HNF3 осуществляется, не напрямую, а, по-видимому, посредством некоего ядерного белка(-ов) [Меркулова и др., 2003]. Представляется вероятным, что либо видоспецифичность связана с избирательным действием этого белка-посредника на HNF3 мыши и HNF3 крысы, либо видоспецифичность обеспечивается избирательной активацией белка-посредника под действием специфичного для данного вида канцерогена. Было выдвинуто предположение, что в качестве такого белка могут выступать рецепторы ксенобиотиков, связывающие многочисленные химические соединения и опосредующие их плейотропные эффекты на организм.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение механизмов, обусловливающих видовую специфичность действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей у мышей и крыс, а также поиск ксеносенсорных белков, способных принимать участие в передаче сигнала от ОАТ и 3’МеДАБ на HNF3.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

  1. Выяснить, связана ли видовая специфичность гепатоканцерогенов ОАТ, 3’МеДАБ с различным действием белков-посредников на транскрипционные факторы HNF3 крысы и HNF3 мыши или же она обеспечивается избирательной активацией белка-посредника под действием специфичного для данного вида канцерогена.
  2. Исследовать участие белка-посредника в действии видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА на HNF3 белки.
  3. Изучить влияние ОАТ, 3’МеДАБ и ДЭНА на ДНК-связывающую активность рецепторов ксенобиотиков: печеночного Х-рецептора (LXR), прегнанового Х рецептора (PXR) конститутивного рецептора андростанов (CAR), рецептора активаторов пролиферации пероксисом (PPAR), арилгидрокарбонового рецептора (AhR) в печени мышей и крыс.
  4. Выяснить, обусловлено ли увеличение ДНК-связывающей активности AhR и CAR под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей изменением содержания этих рецепторов в экстрактах ядер печени.
  5. Изучить способность ОАТ и 3'-МеДАБ специфически связываться с конститутивным рецептором андростанов (CAR).

Научная новизна и практическая значимость. Установлено, что механизмы влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3'-МеДАБ и диэтилнитрозоамина (ДЭНА) на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов HNF3 различны. Видоспецифичность действия аминоазокрасителей на HNF3 определяется избирательной активацией ядерного белка(-ов) под влиянием гепатоканцерогенного для данного вида вещества (3’МеДАБ для крыс, ОАТ для мышей). Механизм действия неспецифического гепатоканцерогенного соединения другого класса ДЭНА не включает белка-посредника.

Показана принципиальная возможность того, что арилгидрокарбоновый рецептор (AhR) и конститутивный рецептор андростанов (СAR) могут выполнять роль белка, опосредующего действие гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на HNF3:

1. Показано, что избирательное увеличение ДНК-связывающей активности рецепторов ксенобиотиков AhR и СAR под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3'-МеДАБ как in vivo, так и in vitro соответствует способности этих веществ снижать ДНК-связывающую активность HNF3 белков.

2. Обнаружено, что при действии видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА, не активирующего белок-посредник, также не активируются CAR и AhR.

3. Показано, что увеличение ДНК-связывающей активности CAR и AhR не обусловлено изменением содержания этих белков в ядрах печени, и в случае CAR связано, по-видимому, с видоспецифическими различиями в связывании этого рецептора с ОАТ и 3'-МеДАБ.

Полученные результаты имеют большое значение для установления механизмов видоспецифичности гепатоканцерогенного действия ОАТ и 3’МеДАБ, а также способствуют выяснению молекулярно-генетических основ предрасположенности или устойчивости организма к возникновению химически индуцированных злокачественных опухолей печени. Кроме того, результаты проведенного исследования могут быть использованы для разработки новых методов тестирования химических соединений на канцерогенность.

Положения, выносимые на защиту.

1. Видоспецифичность влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на транскрипционные факторы HNF3 определяется избирательной стимуляцией белка(-ов)-посредника(-ов), который активируется у крыс гепатоканцерогенным для них 3’МеДАБ, а у мышей гепатоканцерогенным для них ОАТ. Этот белок(-ки)-посредник(-ки) неспецифически снижает ДНК-связывающую активность HNF3 мыши и HNF3 крысы.

2. Избирательная активация рецепторов ксенобиотиков AhR и СAR под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей (но не их неканцерогенных аналогов) как in vivo, так и in vitro сопряжена со способностью этих соединений снижать ДНК-связывающую активность HNF3 белков.

3. Неспецифический гепатоканцероген ДЭНА снижает ДНК-связывающую активность HNF3 в отсутствии белка-посредника и не изменяет активность AhR и СAR.

4. Увеличение ДНК-связывающей активности CAR и AhR не обусловлено изменением содержания этих белков в ядрах клеток печени под влиянием аминоазокрасителей.

5. ОАТ и 3'-МеДАБ способны конкурировать с известным лигандом CAR [3Н]-андростенолом за связывание с белками цитозоля печени мышей и крыс. ОАТ является лучшим конкурентом в цитозоле печени мышей, а 3'-МеДАБ – в цитозоле печени крыс.

6. Арилгидрокарбоновый рецептор (AhR) и конститутивный рецептор андростанов (СAR) могут выполнять роль белков, опосредующих действие гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на HNF3.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II съезде общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию института цитологии РАН (Санкт- Петербург, 2007.), международной конференции «Chemical and biological problems of Proteomics» (Новосибирск, 2004), VIII Дальневосточной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2004), всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, заключения, выводов и списка литературы (204 наименования). Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и содержит 25 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на самцах крыс весом 200г Wistar и 3-х месячных самцах мышей линии A/Не разведения вивария ИЦиГ СО РАН. В экспериментах in vivo ОАТ, 3'-МеДАБ, 4'-МеДАБ растворяли в оливковом масле, ДЭНА в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно по 1 мл на 100г массы тела животных до конечной концентрации 1мМ [Каледин, Захарова, 1984]. Контрольным животным вводили растворитель. В опытах in vitro канцерогены добавляли в объеме не более 1% от объема реакционной смеси: до концентрации 0,1 мМ ОАТ, 3'-МеДАБ, 4'-МеДАБ в виде растворов в ДМСО (диметилсульфоксид), ДЭНА - в физиологическом растворе в гомогенат или ядерный экстракт [Меркулова и др., 2003]. Экстракты ядер получали согласно методу Горски-Шапиро (Gorsky-Shapiro) [Меркулова и др., 2003]. ДНК-связывающую активность факторов транскрипции оценивали методом задержки в геле [Kropachev et al., 2001] во фракции I, осаждаемой при концентрации сульфата аммония 0,32 г/мл, либо в суммарном экстракте ядер, полученном при 0,46 г/мл сульфата аммония. При проведении смешений фракций выделяли фракции I и II ядерного экстракта последовательным осаждением белков при концентрации 0,32 и 0,46 г/мл сульфата аммония. Двуцепочечные олигонуклеотиды, соответствующие известным сайтам связывания факторов транскрипции, и используемые в качестве ДНК-проб, были синтезированы В.Ф. Кобзевым (ИЦиГ СО РАН). Денситометрию радиоавтографов проводили в программе Gel Pro Analyzer 4.0. Содержание транскрипционных факторов в ядерном экстракте оценивали методом Вестерн-блот-гибридизации. Для визуализации результатов использовали ECL–систему “Amersham”. [3H]-андростенол (5-андрост-16-ен-3-ол) с удельной активностью 20-30 Кюри/мМ был получен методом тритиевого обмена Романовой И.В. (ХБиФМ СО РАН). Получение цитозоля клеток печени и изучение связывания [3H]-андростенола с цитозолем проводили по методу описанному ранее [Kropachev et al., 2001]. Статистическую обработку результатов проводили, используя t-критерий Съюдента в программе STATISTICA 5.5.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Специфичность действия белков-посредников в механизме влияния ОАТ, 3МеДАБ на транскрипционные факторы семейства HNF3. Ранее было показано [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003], что, во-первых, в печени мышей и крыс HNF3 ДНК-связывающая активность обеспечивают различные HNF3 белки (HNF3 у крыс и HNF3 у мышей); а во-вторых, существует некий ядерный белок-посредник, необходимый для снижения ДНК-связывающей активности HNF3 при действии гепатоканцерогенных аминоахокрасителей. В ходе сульфатаммонийного фракционирования при выделении экстракта ядер HNF3 оказывается во фракции I, осаждаемой при концентрации сульфата аммония 0,32 г/мл, а белок-посредник – во фракции II, получаемой при 0,46 г/мл. Это дало возможность получить последовательным осаждением из экстракта ядер печени белковые препараты, содержащие HNF3 и посредник, от контрольных и обработанных гепатоканцерогенами животных. Была разработана схема смешений этих препаратов, позволяющая оценить специфичность действия белков-посредников на HNF3. Для этого смешивали фракцию I от контрольных крыс, содержащую HNF3, с фракцией II мышей, обработанных ОАТ (Рис. 1, дорожка 6) и фракцией II крыс, обработанных 3’МеДАБ (дорожка 8); а также объединяли фракцию I контрольных мышей, содержащую HNF3, с фракцией II крыс, обработанных 3’МеДАБ (дорожка 4) и фракцией II мышей, обработанных ОАТ (дорожка 2).

Рис. 1. ДНК-связывающая активность HNF3 при смешивании фракций I и II экстракта ядер печени контрольных и обработанных канцерогенами мышей и крыс

.

Представлен один из трех независимых экспериментов (в каждый эксперимент брали по 2 мыши и 1-2 крысы).

Оказалось, что белок-посредник мыши, активированный ОАТ, одинаково снижает ДНК-связывающую активность HNF3 крыс и HNF3 мышей, а белок-посредник крысы, активированный 3МеДАЬ, одинаково действует на HNF3 крыс и HNF3 мышей (Рис. 1), т.е. белок-посредник действует неспецифично по отношению к разным HNF3 белкам.

Исследование участия белка-посредника в действии ДЭНА. Чтобы исследовать необходимость белка-посредника в действии видонеспецифичного ДЭНА, канцероген добавляли непосредствено к фракции I, не содержащей белка-посредника; для контроля во фракцию I вводили 3'-МеДАБ.

Рис. 2. ДНК-связывающая активность HNF3 (в относительных единицах) при добавлении 3'МеДАБ и ДЭНА во фракцию I ядерного экстракта печени крыс.

Результаты представлены в % от интенсивности сигнала в полосе задержки при инкубации с экстрактом от контрольных животных (принята за 100% в каждой электрофореграмме). В скобках указано число экспериментов. В каждый эксперимент брали по одной-две крысы. * - достоверность отличий значений по сравнению с контрольным уровнем составила 99%.

Pages:     || 2 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»