WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Контрольными являлись крысы аналогичных экспериментальным возрастных групп, которые также по 6 особей находились 4 часа в герметически закрытой затравочной камере в тех же условиях, что и опытные, но без присутствия серосодержащего газа.

Животные выводились из эксперимента путем передозировки эфирного наркоза. Из бедренных костей выделялся костный мозг, часть которого шла на исследование эритробластических островков, а другая – на изучение перекисного окисления липидов.

Подсчет количества эритроцитов осуществлялся по стандартной методике с помощью камеры Горяева в периферической крови, которая забиралась из хвостовой вены экспериментального животного.

Метод выделения и подсчета эритробластических островков (ЭО) костного мозга крыс

Выделение из костного мозга крыс островков эритроидной ткани — эритробластичееких островков — осуществлялось с по­мощью метода, разработанного Ю.М.Захаровым, И.Ю.Мель­никовым и А.Г.Рассохиным (1990).

У животных после эвтаназии извлекали бедренные кости. Мягкие ткани убирали сухой марлевой салфеткой после чего осторожно отсекали проксимальный конец кости, обнажая костный мозг и вскрывая костномозговой канал. На этот конец кости надевали переходную резиновую трубку, плотно ох­ватывающую кость. Затем осторожно отсекали дистальный ко­нец кости. Другой конец переходной трубки надевали на канюлю шприца с 1 мл среды выделения. В 100 мл среды выделения содержалось 60 мл питательной среды Игла, 33 мл 10 % раствора альбумина человека, 1 мл неразбавленного гепарина с активностью 5000 ЕД/мл, 10 000 ЕД пенициллина и 10 мг стрептомицина.

Энергичным надавливанием на поршень шприца кост­ный мозг вымывали из канала бедренной кости в пробирку. Все манипуляции повторяли со второй бедренной кос­тью. В итоге в пробирке оказывалось два столбика костномоз­говой ткани.

Для приготовления суспензии клеток костного мозга, содержащей ЭО, применяли механическую диссоциацию столбиков костномозговой ткани с помощью пипетки Пастера и небольшой резиновой груши. Внутренний диаметр наконечника пипетки был равен примерно 1 мм. Быстрое перемещение клеточной взвеси через кончик пипетки производили 10-15 раз. После пипетирования клеточную взвесь фильтровали через ячейки 0,1 х 0,1 мм металлической сетки, освобождаясь от волокон стромы и сосудов. Весь интервал времени от наркотизации животного до получе­ния взвеси с ЭО не превышал 8—10 мин.

Для выявления ЭО использовали их прижизненную окраску ней­тральным красным. С помощью пипеточного дозатора на часовом стекле смешивали 0,1 мл полученной взвеси клеток костного мозга с 0,1 мл 0,1% раствора нейтрального красного, приготовленного растворением красителя в изотоническом растворе натрия хлорида, и с 0,1 мл среды выделения.

Для подсчета ЭО камеру Горяева заполняли взвесью окрашенных клеток и помещали её во влажную чашку Петри на 10—20 мин для осаждения и распластывания ЭО на дне камеры. ЭО под­считывали над всей сеткой, т.е. в 225 больших квадратах при увеличении 200 и полузакрытой шторке конденсора микроско­па. В камере Горяева ЭО выглядели как скопления клеток правильной округлой формы с красным окрашиванием в цент­ре за счет включения нейтрального красного в лизосомы мак­рофага ЭО. Расчет абсолютного содержания ЭО в костном мозге одной бедренной кости производили по формуле:

где А — число ЭО костного мозга бедренной кости крысы, тыс./бедро; n — число ЭО в 225 больших квадратах камеры Горяева; 3 — разведение исходной взвеси; 2000 — общий объем полученной взвеси клеток костного мозга, мм3; 0,9 — объем камеры Горяева, мм3; 2 — две бедренные кости.

Количественные показатели эритропоэза в эритробластических островках

Расчет количественных показателей, характери­зующих состояние эритропоэза в ЭО, производился по методу Л.В.Ворговой и Ю.М.Захарова (1990) на основе полученных данных о количестве ЭО в кост­ном мозге животных и их распределении по классам зрелости (Zakharov Y.M., Prenant M., 1982; Захаров Ю.М. с соавт., 1990).

1."Общее количество колонеобразующих единиц эритроцитов (КОЕэ), вступивших в дифференциацию" как сумма всех ЭО и ЭО реконструирующихся ( ЭОрек ) в костном мозге одной бедренной кости:

А1 = ЭО + ЭОрек.

2."Показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в диффе­ренциацию" как сумма ЭО 1-го класса зрелости и реконструи­рующихся ЭО в костном мозге одной бедренной кости:

А2 = ЭО1 + ЭОрек.

3."Показатель созревания ЭО" как отношение ЭО с созре­вающими эритроидными клетками к ЭО с пролиферирующими клетками:

А3 =

4. "Показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз" как отношение числа реконструирующихся ЭО к числу инволюцирующих:

А4 =

Исследование перекисного окисления липидов в костном мозге

Состояние перекисного окисления липидов в костном мозге оценивали по содержанию в нем малонового диальдегида, которое определялось по ме­тодике Ю.А.Владимирова и А.И. Арчакова (1972) в модифика­ции И.Д.Стальной и Т.Т. Гаришвили (1977).

Для этого навеску в 500 мг костного мозга растирали в гомогенизаторе Даунса тефлоновым пестиком в 19,5 мл 1,2% раствора КС1, охлажденного до +4°С. Затем в три пробирки разливали:

в 1 пробирку - 2 мл гомогената + 0,2 мл дистиллиро­ванной воды

во 2 пробирку - 2 мл гомогената + 0,1 мл 2,6 мМ раствора аскорбиновой кислоты + 0,1 мл 4*10-5М раствора соли Мора

в 3 пробирку - то же, что и во вторую + 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ)

Все пробирки помещались в водяную баню на 10 минут при +37° С, после чего в первые две пробирки прибавляли по 1 мл 40% раствора ТХУ.

Все пробирки центрифугировали в течение 10 минут при ЗООО об/мин. В три чистые пробирки наливали по 2 мл надосадочной жидкости и по 1 мл 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК), после чего их помещали в кипящую водяную баню на 10 ми­нут. После этого пробирки охлаждали в холодной воде до ком­натной температуры. Измерение оптической плотности произ­водили при длине волны света 535 нм в микрокюветах. Коэффициент молярной экстинкции малонового диальдегида =156*103M-1 см-1.

Статистическая обработка результатов исследования

При планировании исследования были приняты следующие константы: доверительный интервал ()= 10% (Автандилов Г.Г., 1977; 1990); уровень значимости (Р)<= 0.05, критерий Стьюдента (t) = 2, вероятность безошибочного прогноза >= 95% (Лакин Г.Ф., 1990).

Количественные данные, полученные в ходе выполнения исследования, проанализированы методами вариационной статистики, корреляционного анализа и определения достоверности различий. При проведении статистической обработки использовалась утилита OpenOffice Calc из свободно распространяемого программного продукта OpenOffice (Ver. 3.0), работающая под управлением операционной системы Windows XP Home Edition (сертификат OEM X12-53766).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования уровня ПОЛ в красном костном мозге на различных этапах постнатального онтогенеза интактных белых беспородных крыс с помощью определения концентрации малонового диальдегида (МДА) продемонстрировали его прогрессирующее увеличение с возрастом. Наивысший уровень ПОЛ зарегистрирован у животных старческого периода онтогенеза. Данный факт говорит в пользу предположения о проградиентной возрастной деградации механизмов антиоксидантной защиты.

Воздействие газообразных серосодержащих поллютантов интенсифицирует ПОЛ в костном мозге у экспериментальных животных на всех этапах онтогенеза. Это подтверждается активацией процессов перекисного окисления липидов и в других цитомембранах в этих условиях, что приводит к увеличению “текучести” биомембран (Резаев А.А., Пушкарев В.А., Пушкарев А.С., 1991; Резаев А.А., Лазько А.Е., Надеждина И.Н., 1993).

Наиболее интенсивно процессы ПОЛ происходят в неполовозрелом возрасте животных, что, вероятнее всего, свидетельствует о возрастной неразвитости систем антиоксидантной защиты. Но, так как исходный уровень ПОЛ на этом этапе онтогенеза является самым низким, даже такое резкое повышение образования перекисей не обеспечивает его наивысшего уровня. Наибольшей активностью ПОЛ отличается старческий возраст, где достаточно скромная интенсификация данного процесса под действием интоксикации суммируется с самым высоким исходным возрастным уровнем образования перекисей в красном костном мозге.

Исследование возрастной динамики содержания эритроцитов в периферической крови белых беспородных крыс показало статистически достоверное прогрессирующее снижение их числа на всех рассматриваемых этапах онтогенеза. Мы связываем это с аналогичным возрастным уменьшением абсолютного количества ЭО в костном мозге, зарегистрированным в нашем исследовании.

Воздействие газообразных серосодержащих поллютантов приводит к эритроцитозу у экспериментальных животных, который выражается в высокодостоверном увеличении числа эритроцитов во всех возрастах. Наиболее негативно интоксикация сказывается на красной крови неполовозрелых животных, в то время как животные зрелого возраста демонстрируют относительную устойчивость в этом отношении.

Наши данные подтверждают результаты исследований T.A.Beruashvili (1980), который сообщил, что у кошек вдыхание сероводорода (0,09 об% (900 ppm) 5 мин.) увеличивало число циркулирующих эритроцитов. Схожая реакция наблюдалась и у кроликов, но для этого требовалась большая концентрация сероводорода (0,17 об%, 1700 ppm), по сравнению с кошками.

Очень ценно в этом отношении исследование, проведенное В.И.Балашовым с соавторами в 1993 г. на материале планового медицинского осмотра 537 рабочих основных и вспомогательных производств Астраханского газоперерабатывающего завода (АГПЗ). Оно выявило наличие у некоторых их них признаков скрытой гипоксии, выражающихся в увеличении числа эритроцитов и гемоглобина. Изучение гематологических показателей у работников различных производств АГПЗ показало, что обнаруженные изменения сильнее выражены на основных производствах по сравнению с вспомогательными.

Воздействие газообразных серосодержащих поллютантов на эритрон вызывает парадоксальную, на первый взгляд, реакцию. На неполовозрелом и зрелом этапах онтогенеза наблюдается возрастание абсолютного числа ЭО, особенно значительное в первом, а в старческом – уменьшение данного показателя. Мы связываем данные факты с наличием значительного функционального резерва эритрона и реализацией этого резерва при внешнем стрессорном воздействии в молодом возрасте и практическим исчерпанием данного резерва в старческом, когда приспособление к токсическому агенту вынуждено происходить за счет дефекта системы.

Мы согласны с авторами, которые считают, что по мере увеличения возраста и, особенно, длительности контакта с серосодержащими поллютантами, происходит постепенное истощение эритрона, выражающееся в плавном, но малообратимом ухудшении морфофункциональных показателей мембран эритроцитов (Рыбальченко В.И., Коганов М.М., 1988; Бучин В.Н. с соавт., 1993).

Корреляционный анализ подтвердил эмпирически найденную зависимость между уровнем ПОЛ и абсолютным количеством ЭО в красном костном мозге бедренной кости. Как и предполагалось, эта зависимость оказалась обратно пропорциональной, сильной и подверженной влиянию интоксикации. Токсическое воздействие значительно ослабляет и дезорганизует регуляцию в системе эритрона, что подтверждается уменьшением коэффициента детерминации в данной системе с 76% до 59%.

Дифференцированное исследование возрастной динамики количества и морфологии ЭО различных типов в норме и в условиях воздействия газообразных серосодержащих поллютантов позволяет выявить тонкие механизмы нарушения эритропоэза в данном случае.

В ответ на токсическое воздействие возрастает число ЭО тех типов, которые относятся к пролиферирующим (ЭО1, ЭО2, ЭОрек). Это можно объяснить стремлением системы регуляции эритрона компенсировать гипоксические явления интоксикации увеличением числа эритроцитов. В то же время падает содержание ЭО, в которых происходит функциональное становление эритроцитов (ЭО3, ЭОинв). Суммирующий вектор этих двух процессов приводит, как уже отмечалось выше, к эритроцитозу, в ответ на токсическое воздействие. Можно высказать достаточно обоснованное предположение, что эти многочисленные, но не полностью созревшие эритроциты могут быть в той или иной степени функционально неполноценными.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что вышеописанные процессы наиболее интенсивно проходят в неполовозрелом возрасте, их выраженность уменьшается в зрелом и затухает в старческом. По нашему мнению это является выражением тенденции истощения резервных возможностей эритрона в процессе постнатального онтогенеза.

Рис.1. Реконструирующийся ЭО крысы неполовозрелого возраста с вакуолизированным центральным макрофагом. Окраска нейтральным красным. Ув.х90.

Морфологически токсическое воздействие более всего сказывается на центральных макрофагах эритробластических островков (Рис.1.). Выявляются разнообразные в количественном и качественном отношении неспецифические признаки их деструкции – увеличение или, наоборот, пикноз, крупная или мелкодисперсная вакуолизация.

Функциональные показатели эритропоэза четко реагируют на токсическое воздействие. Наиболее резко это происходит в неполовозрелом возрасте. Динамика данных показателей в зрелом возрасте свидетельствует о достижении определенной устойчивости систем регуляции эритрона, несмотря на токсическое воздействие. Старческий возраст экспериментальных животных характеризуется снижением уровня управляемости эритрона, о чем свидетельствует разнонаправленная динамика функциональных показателей. Так, если показатель А3 приближается к возрастной норме, что свидетельствует о достаточном уровне процесса созревания ЭО, то значения остальных показателей находятся ниже нормы. Особенно страдает процесс повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз, что следует из очень низкого значения А4. Данное обстоятельство, по нашему мнению, значительно снижает функциональные возможности адаптации эритропоэза.

Как и следовало ожидать, использование антиоксидантов в качестве протекторов токсического действия серосодержащего газа снижало концентрацию МДА в костном мозге бедренных костей крыс. Характер этого процесса подтверждает представления о наибольшей экосенситивности эритрона в неполовозрелом возрасте, его относительной устойчивости в зрелом и усугубляющейся разбалансировке процессов саморегуляции эритропоэза в старческом.

Аналогичное заключение можно сделать, анализируя возрастную динамику содержания эритроцитов в периферической крови животных и ЭО в костном мозге.

Использование корреляционного анализа для выявления влияния протектора продемонстрировало увеличение возможности управляемости адаптацией эритрона в данном случае. Это было подтверждено также увеличением коэффициента детерминации этой системы до 77%.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»