WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Мы попытались также сопоставить выраженность защитного эффекта семакса от Н2О2–индуцированного повреждения на культивируемых клетках септума и гиппокампа. Как показали результаты, между ними не наблюдалось существенных различий в величине исследуемого параметра. При этом эффект защиты был достоверно более выражен (р<0.05) при предварительном (за 24 ч до ОС) введении пептида к культурам септума и гиппокампа (при введении Н2О2 0,5мМ 36 и 17,54%, соответственно).

Основываясь на данных Гривенникова И.А. и Долотова О.В. (2004) можно предположить, что наблюдавшийся нами защитный эффект семакса может быть обусловлен также увеличением уровня экспрессии таких нейротрофических факторов как NGF, BDNF имеющих выраженные нейропротекторные свойства. Возможно, что суточная инкубация семакса (10 мкг/мл) с культивируемыми клетками септума и гиппокампа способствует образованию более высокого уровня нейротрофинов, чем при 45 мин инкубации нервных культур с пептидом. Соответственно, защитный эффект при суточной инкубации с семаксом оказался более выраженным, чем при его 45 мин инкубации.

В работе Сторожевых Т.П. и соавторов (2007) было показано, что семакс увеличивает выживаемость культивируемых зернистых клеток мозжечка, замедляя при этом развитие кальциевой дизрегуляции и изменяя митохондриальный потенциал. Основываясь на приведенных данных, можно сделать еще одно предположение о нейропротекторном действии семакса. Вероятно, одно из возможных объяснений нейропротекторного действия семакса в может заключаться в способности гептапептида оказывать влияние на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий.

Ионы Са2+

Внесение семакса после 15 мин инкубации с Н2О2 приводило к снижению уровня повреждения ~на 30% (рис.2). Несколько менее выраженное уменьшение повреждения наблюдалось при одновременном введении к клеткам А23187 и семакса (на 18%), тогда как не наблюдалось достоверного снижения повреждения при введении пептида в присутствии Са+2. Основываясь на этих данных, можно предположить, защитный эффект семакса от повреждающего действия Н2О2 может быть связан с переходом клеточной мембраны к более стабильному состоянию за счет снижения мембранного потенциала, в то время как ПОЛ способствует его росту (Пучкова Т.В. и др., 1983; Сторожевых Т.В., 2007). Снижение защитного эффекта семакса в присутствие Са2+ или ионофора А23187 может быть связано с нарушением механизмов, лежащих в основе формирования протекторного действия семакса, а именно с его способностью влиять на кальциевый гомеостаз, митохондриальный потенциал клеток (Сторожевых Т.В., 2007) и на структуру плазматических мембран клеток.

Повреждение клеточных мембран, вызванное ультрафиолетовым

облучением

Данные, представленные на рис.7 (1) показывают, что через 15 мин после окончания УФ-облучения в популяции макрофагов наблюдалось дозозависимое возрастание относительного содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной, достигавшего при 12 Дж/см2 величины 90%. Увеличение времени инкубации клеток после облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 от 15 до 60 мин приводило к значительному возрастанию (в 2-3 раза) числа поврежденных клеток (рис. 7, 2). Величина этого эффекта существенно снижалась при введении в среду инкубации клеток сразу после окончания облучения семакса в концентрации 100 мкг/мл (рис. 7, 3). В тоже время, его аналог в тех же условиях практически не снижал выраженности повреждающего действия (рис. 7, 4). Существенное возрастание числа поврежденных клеток в ходе 60-минутной инкубации макрофагов уже после окончания облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 обусловлено развитием в этих «темновых» условиях перекисных процессов, инициированных в период освещения. Отсутствие этого эффекта после облучения клеток в дозе 4 Дж/см2 связано, вероятно, с недостаточностью для развития процессов цепного перекисного окисления содержания липидных перекисей и достаточно высокой активностью систем антиоксидантной защиты в макрофагах. Отсутствие развития повреждений после облучения клеток в дозе 12 Дж/см2 обусловлено тем, что в этих условиях уже через 15 мин после окончания облучения практически все клетки в препарате макрофагов оказываются поврежденными.

Отсутствие защитного эффекта семакса после облучения клеток в дозе 12 Дж/см2 позволяет предположить, что его протекторное действие в период после УФ-облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 связано со способностью пептида предотвращать развитие мембранных повреждений (но не восстанавливать уже поврежденные мембраны), наиболее вероятно, за счет снижения активности процессов ПОЛ. Не исключено также участие в этих событиях ферментных систем антиоксидантной защиты макрофагов, а также изменений в Са2+-обменных реакциях клеток-фагоцитов, обнаруженных при действии семакса (Асташкин Е.И. и др., 2000). Полученные нами

Рис. 7. Влияние регуляторного пептида семакса и его аналога на выраженность повреждающего действия УФ-излучения на перитонеальные макрофаги мышей.

По оси абсцисс – дозы УФ-излучения (Дж/см2); по оси ординат – относительное содержание клеток с поврежденной плазматической мембраной (%). Подсчет числа поврежденных клеток в препаратах проводили через 15 мин после окончания их облучения (1), а также через 60 мин после окончания облучения как в отсутствие добавок (2), так и в присутствии семакса (3) или его аналога (4).

данные показали также, что защитный эффект семакса был специфичен, поскольку он не наблюдался при использовании в тех же условиях его аналога.

Реализация уф-излучения связана с процессами ПОЛ. Результаты наших экспериментов (рис.5, 7,) показали, что семакс способен влиять на развитие ПОЛ, снижая при этом количество поврежденных клеток в популяции. Основываясь на сведениях из литературных источников и собственных результатах, можно предположить, что протекторные эффекты семакса могут быть реализованы за счет нерецепторного взаимодействия с клеткой, а именно, за счет его способности напрямую влиять на химический состав мембран, изменяя при этом их физико-химические свойства.

Влияние семакса на некоторые функциональнометаболические параметры клеток.

Внутриклеточный рН

Как известно (Литинская Л.Л. и др., 1987; Busa W.B., Nuccitelli R., 1984) внутриклеточный рН играет существенную роль в регуляции клеточных функций и, следовательно, в формировании ответа клетки на действие биологически активных факторов внешней среды. При этом в литературе имеются указания на то, что увеличение концентрации ионов водорода может повышать устойчивость плазматических мембран к действию ряда повреждающих агентов (Пирутин С.К. и др., 2002). Важно отметить, что сдвиги рН инициируют трансформацию мембран за счет изменения физико-химического состояния липидов (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993). В этой связи мы рассмотрели предположение о том, что защитный эффект семакса может реализоваться через снижение им внутриклеточного рН макрофагов. Действительно, инкубация перитонеальных макрофагов (рис.8) и нервных клеток с семаксом, в условиях, при которых наблюдается снижение им повреждающего действия Н2О2 на мембраны клеток, сопровождается снижением их внутриклеточного рН. Повышение устойчивости клеток к повреждающему действию ОС мы наблюдали также и при снижении рН в среде инкубации клеток, которое также приводило к снижению их внутриклеточного рН. При подщелачивании подобный эффект не наблюдался. Следует обратить внимание также и на отсутствие эффекта снижения рНi при инкубации обоих типов клеток с аналогом семакса, который не обладал также и защитным эффектом при Н2О2-индуцированном повреждении клеточных мембран. Это является дополнительным указанием на роль ионов Н+ в клеточных эффектах семакса.

Полученные нами данные позволяют предположить возможность участия ионов водорода в реализации защитного действия семакса на клетки. Кроме того, эффект снижения рНi при действии пептида является, по-видимому, общим для разных типов клеток (по крайней мере, для макрофагов, клеток септума и клеток-зерен мозжечка), а также специфичным, поскольку аналог пептида не вызывал внутриклеточного подкисления.

Как видно из данных представленных на рисунке 8, 20-минутная инкубация перитонеальных макрофагов с семаксом приводит к подкислению их внутриклеточного содержимого. При этом увеличение концентрации пептида от 0,1

Рис.8. Концентрационная зависимость влияния семакса и его аналога на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей.

По оси абсцисс - концентрация семакса () и его аналога (), мкг/мл; по оси ординат – изменение величины внутриклеточного рН макрофагов по сравнению с контролем (до введения пептида), рНi. Инкубацию клеток с агентом проводили при температуре 220C в течение 20 мин.

до 100 мкг/мл приводит к существенному уменьшению рНi. Изменение рНi не наблюдалось при замене семакса на его аналог, что указывает на специфичность наблюдаемого эффекта. Сходным образом действовали семакс и его аналог (10 мкг/мл) и на клетки септума и клетки-зерена мозжечка крыс (рис.9). 20-минутная инкубация клеток с пептидом приводила к подкислению их внутриклеточного содержимого. В то же время, аналог семакса либо не вызывал достоверных изменений рНi (в случае клеток септума), либо даже увеличивал его (в случае клеток-

Рис.9. Влияние семакса и его неактивного аналога на внутриклеточный рН культивируемых клеток септума и клеток-зерен мозжечка.

Данные представлены в виде изменения величины внутриклеточного рН культивируемых клеток-зерен мозжечка () и клеток септума () по сравнению с контролем (до введения пептида), (рНi). Инкубацию с семаксом или его неактивным аналогом (10 мкг/мл) проводили при температуре 220C в течение 20 мин.

зерен мозжечка) по сравнению с контролем. Базируясь на данных о наличии у семакса в концентрации 10 мкг/мл выраженной способности защищать макрофаги от повреждающего действия Н2О2, мы изучили временную зависимость изменения рНi перитонеальных макрофагов мышей при действии пептида в этой концентрации. Было выявлено, что уже через 5 мин инкубации клеток с пептидом наблюдается достаточно выраженное уменьшение величины внутриклеточного рН (на 0,13±0,01 ед.рН). Снижение рНi продолжается, достигая к 25-ой мин величины 0,18±0,01 ед.рН.

Таким образом, основываясь на вышеперечисленных фактах, мы можем сделать предположение, что протекторные свойства семакса могут реализовываться за счет снижения уровня внутриклеточного рН.

Образование в макрофагах активных форм кислорода

Полученные данные о влиянии семакса на образование активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах были сопоставлены с их реакцией на классический иммуномодулирующий регуляторный пептид тафцин, обладающим выраженным фагоцитстимулирующим действием. Было показано, что действие обоих пептидов приводит к возрастанию величины НСТ-теста, причем, ответ клеток на действие семакса оказывается несколько более выраженным. При этом эффективность совместного действия тафцина и семакса практически не отличается от такового одного семакса, что, по-видимому, можно рассматривать как указание на то, что реализация наблюдаемого эффекта у обоих пептидов идет по сходному пути. Полученные результаты можно расценить как указание на повышение внутриклеточных метаболических процессов в клетках фагоцитах при действии исследованных регуляторных пептидов.

Дегидрогеназная активность митохондрий в клетке

В наших экспериментальных условиях МТТ-тест можно, по-видимому, рассматривать и как параметр, позволяющий оценить уровень дегидрогеназной активности клеток. Это связано с тем, что используемые в опытах культуры клеток септума и гиппокампа содержали очень небольшое количество глиальных клеток и находились в бессывороточной нейробазальной среде с добавкой В-27 в течение опытов, что исключало возможность индукции процессов пролиферации клеток. Известно также, что семакс не увеличивает пролиферацию нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы (Сафарова Э.Р. и др., 2003). В этом случае полученные результаты указывают на то, что действие семакса на клетки приводит к возрастанию их дегидрогеназной активности примерно в одинаковой степени для обоих типов клеток. Выявлено, что повышение дегидрогеназной активности при действии семакса оказывается более выраженным при его введении за 24 ч до ОС примерно на 18 и 36%, соответственно (рис.10).

Рис.10. Влияние семакса на уровень дегидрогеназной активности культивируемых клеток гиппокампа и септума.

По оси абсцисс – время инкубации культивируемых клеток гиппокампа () и септума () с семаксом (10 мкг/мл). По оси ординат – разница между величиной МТТ-теста в клетках, инкубировавшихся с семаксом и без него (%).

Судя по полученным нами результатам при 24 часовой инкубации обоих типов клеток с семаксом (10 мкг/мл) происходит достоверное возрастание дегидрогеназной активности клеток по сравнению с контролем, достоверно более выраженное для клеток септума. В то же время подобный эффект не наблюдался при 45 минутной инкубации клеток.

Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы Долотова О.В., (2004), в которой семакс максимально увеличивал экспрессию нейротрофинов мРНК NGF и BDNF в несколько раз через 40-60 мин в культивируемых клетках гиппокампа, базальных ядрах переднего мозга и в их глие. Увеличение на 40% по сравнению с контролем наблюдалось через сутки в гиппокампе. Возможно также, что семакс реализует свои протекторные свойства за счет влияния на кальциевый гомеостаз и митохондриальный потенциал (Сторожевых Т.В., 2007).

Анализ литературных данных, а также наши собственные результаты, позволяют с известной долей осторожности сделать вывод о том, что семакс может повышать энергетический уровень и функционально-метаболическую активность клеток, подвергнутых воздействию ОС.

Заключение

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»