WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Из рисунка 1 также видно, что существенное увеличение числа поврежденных клеток наблюдалось нами также при повышении температуры инкубации от 200 до 370С, что, по-видимому, объясняется усилением ПОЛ с ростом температуры (Владимиров Ю.А., 2000). Анализ временной зависимости развития эффекта Н2О2 (1мМ) на макрофаги показывает, что возрастание времени воздействия приводило к постепенному повышению процентного содержания поврежденных клеток, достигавшего 90% к 60-ой мин инкубации. Существенно при этом отметить, что развитие повреждения продолжалось и после переноса клеток в среду без Н2О2. Так,

Рис.1. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии Н2О2.

По оси абсцисс - концентрация Н2О2, мМ; по оси ординат - относительное содержание в популяции макрофагов клеток с поврежденной плазматической мембраной, %. Инкубацию клеток с Н2О2 проводили в течение 30 мин при температуре 200С () и 370С (). Здесь и далее: *-различия между средними значениями исследованного параметра считали достоверными при р 0,05.

после инкубации клеток с Н2О2 в течение 15 или 30 мин дополнительная их инкубация уже в отсутствие перекиси в течение 45 или 30 мин приводила к возрастанию содержания в популяции поврежденных клеток, примерно, в 4,5 и 1,7 раза, соответственно.

Все данные хорошо укладываются в рамки существующей на сегодняшний день теории, согласно которой ключевым моментом в процессе повреждения мембран во время ОС является ПОЛ мембран и, как следствие, нарушение целостности бислоя в результате формирования гидрофильных пор (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993; Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996; Владимиров Ю.А., 2000).

Таким образом, полученные нами данные показали, что действие Н2О2 на перитонеальные макрофаги мышей in vitro сопровождается зависящим от температуры, времени инкубации и концентрации агента нарушением целостности их плазматических мембран.

Ионы Са+2

Как видно из данных, представленных на рисунке 2, инкубация клеток в присутствии ионов Са2+ (2мМ) или Са+2-ионофора А23187 (0,5 нг/мл) в течение 60 мин приводила к небольшому повышению (около 20%) содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной мембраной. Добавление Са2+ или А23187 к клеткам, подвергнутым предварительному повреждающему воздействию Н2О2 также приводило лишь к небольшому дополнительному возрастанию повреждения клеток (на 20% и 10%, соответственно). Полученные данные указывают, по-видимому, на независимость механизмов повреждающего действия Н2О2 и вышеуказанных агентов. Возможным объяснением увеличения степени повреждения клеток при 60 мин инкубации клеток на фоне повышенной концентрации Са+2 может являться то, что

Рис.2. Влияние ионов Са+2 на способность семакса защищать макрофаги от повреждающего действия Н2О2.

Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после окислительного стресса, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие пептида (, К). Семакс (10 мкг/мл), СаСl2 (2мM) и А23187 (0,5 нг/мл) добавляли к клеткам сразу после их отмывки от Н2О2 либо по-отдельности (), либо в сочетаниях семакса с СаСl2 или А23187 (). В ряде экспериментов инкубацию клеток с СаСl2 или А23187 осуществляли в течение 60 мин без предварительной инкубации с Н2О2 ().

увеличение содержания ионов кальция внутри клетки вследствие их проникновения через мембрану из внеклеточной среды способствует снижению активности протеинкиназы С, фосфорилирующей многие белки, активации фосфолипаз и ферментов, инициирующие процессы ПОЛ (Nicholls D.G., 2004). Кроме того, множество ферментов в клетке и в митохондриях являются кальций зависимыми. Аккумуляция ионов Са+2 в матриксе митохондрий приводит к падению их мембранного потенциала митохондрий (Mattson M.P. et al., 1993). Значительное падение мембранного потенциала приводит к реверсу АТФ-синтетазы и истощению запаса АТФ в клетках (Brustovetsky N. et al., 2000). Излишнее поступление ионов Са+2 в митохондрии приводит к образованию поры неспецифической проницаемости и набуханию, что стимулирует активность компонентов дыхательной цепи (Belous A. et al., 2004), а это, в свою очередь, ведет к увеличению продукции АФК (Batandier C. et al., 2004; Budd S.L. et al., 1996).

45-минутная инкубация клеток в присутствие кальциевого ионофора А23187 и СаСl2 после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ), приводит к незначительному увеличению содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (рис.2). Можно предположить, что небольшое возрастание количества поврежденных клеток в результате ОС на фоне повышенного содержания ионов Са2+ связано с тем, что Н2О2 –индуцированные процессы сами по себе инициируют ПОЛ, следствием которого является увеличение проницаемости мембран, в том числе и для ионов кальция. Добавление к среде инкубации СаCl2 или А23187 после инкубации с Н2О2 уже не вызывает достоверных изменений величины повреждения.

Ионы Н+

Помимо того, что ионы Н+ играют важную роль в процессах внутриклеточной регуляции и реализации действия различных факторов (Литинская Л.Л., и др., 1987; Busa W.B., Nuccitelli R., 1984), изменение рН способствует также изменению физико-химических свойств мембран (Котык А., Яначек К., 1980; Пирутин С.К. и др., 2002). Дополнительным подтверждением этому служат и наши данные (рис.3), показывающие, что при изменении внеклеточного уровня рН и, как следствие – внутриклеточного, происходят выраженные изменения чувствительности перитонеальных макрофагов к повреждающему действию Н2О2. Было выявлено, что снижение рН инкубационной среды от величины 7,2 (в контроле) до величины 6,9 приводит к достоверному снижению повреждающего действия на макрофаги Н2О2 (около 20%). При этом повышение внеклеточного рН до величины 7,5 не сопровождается достоверным изменением Н2О2-индуцированного повреждения клеток. Следует отметить, что при снижении внеклеточного рН до 6,9 имело место постепенное уменьшение рНi, достигавшее к 25 мин инкубации величины около 0,3 ед. рН (рис.4). Подкисление внутриклеточного содержимого сопровождалось достоверным снижением повреждения, в то время как подщелачивание увеличивало его выраженность.

Рис.3. Влияние изменения внутри- и внеклеточного pH перитонеальных макрофагов на выраженность повреждающего действия на них Н2О2.

Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие агентов (, К). Температура инкубации составляла 370. Смену стандартной среды инкубации (рН 7,2) на среду с рН 6,9 () или 7,5 () осуществляли сразу после их отмывки от Н2О2.

Рис. 4. Влияние снижения рН среды инкубации на внутриклеточный рН макрофагов мышей

По оси абсцисс - время от момента смены стандартной среды инкубации (рН 7.2) на таковую с рН 6.9, мин; по оси ординат - изменение величины внутриклеточного рН макрофагов по сравнению с контролем (до смены среды) (рНi). Инкубацию клеток проводили при 220С.

Судя по имеющимся в литературе данным (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993; Penttila А., 1976), значительную роль в реализации этого явления может играть связанный со снижением рН переход структуры мембраны в состояние, более устойчивое к действию ПОЛ. Таким образом, внутриклеточный рН является важным фактором, несомненно, участвующим в реализации ответов клеток на действие различных агентов.

Лекарственный препарат мексидол

Добавление в среду инкубации клеток лекарственного препарата мексидола, приводит к снижению Н2О2–индуцированного повреждения примерно на 10% (1 мкг/мл) и 40% (10 мкг/мл). Судя по полученным результатам, величина наблюдаемого эффекта зависит от концентрации препарата и достоверно отличается от контроля лишь при его концентрации не менее 10 мкг/мл.

Анализируя собственные данные и результаты других авторов (Дюмаев К.М. и др., 1995; Девяткина Т.А. и др., 1999), можно сделать предположение о том, что протекторное действие мексидола в условиях ОС может быть обусловлено его мембраностабилизирующим действием, являющимся результатом угнетения ПОЛ мембран, изменением их фосфолипидного состава и нормализацией функционирования мембраносвязанных ферментов.

Защитное действие семакса при Н2О2-индуцированном повреждении плазматических мембран клеток

Концентрация семакса

Представленные на рисунке 5 данные показывают, что семакс концентрационнозависимым образом способен снижать выраженность повреждающего действия Н2О2 на перитонеальные макрофаги мышей. Защитный эффект пептида существенно возрастал при увеличении его концентрации от 0,1 до 10,0 мкг/мл, но уже не изменяется при переходе к концентрации 100 мкг/мл. Существенно, что при использовании вместо семакса его аналога защитное действие пептида практически исчезает. Это указывает на специфичность действия семакса, возможно, обусловленную реализацией его действия через связывание с соответствующим рецептором. Специфичность действия семакса была выявлена нами и при изучении действия Н2О2 на клетки-зерна мозжечка крыс.

Рис.5. Влияние семакса и его аналога на выраженность повреждающего действия Н2О2 на перитонеальные макрофаги мышей.

По оси абсцисс - концентрация семакса () и его аналога (), мкг/мл; по оси ординат – относительное содержание поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие пептида (,К). Пептид в соответствующих концентрациях добавляли к клеткам сразу после окончания их инкубации с Н2О2 и отмывки от нее.

Поскольку наличие рецептора к семаксу на мембране макрофага пока не доказано, модель нерецепторного взаимодействия с клеткой представляется нам также интересной. Возможно, что исследуемый гептапептид реализует свои протекторные свойства за счет изменения физико-химических свойств плазматической мембраны как это способны делать его аналоги, фрагменты АКТГ (Hershkowitz M. et al., 1982; Verhallen P.F. et al., 1984; Van der Zee C.E. et al., 1989; Roux M. et al., 1997). Известно, что аналогичным эффектом обладают и сдвиги рН, инициирующие трансформацию мембран за счет изменения физико-химического состояния липидов (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993). В этой связи мы можем сделать предположение о том, что защитный эффект семакса может реализоваться через снижение им внутриклеточного рН макрофагов, влияющее на конформацию плазматических мембран клеток, увеличивая при этом их устойчивость к процессам ПОЛ.

Иммуномодулирующий пептид тафцин

Как оказалось, регуляторный пептид тафцин, имеющий в отличие от семакса иммуномодулирующую направленность действия и соответствующие рецепторы на поверхности макрофагов (Lipton J.M., 1997; Getting S.J. et al., 1999) также обладал способностью защищать эти клетки от Н2О2 – индуцированного повреждения. При этом аналог пептида (2ТФ-LPA) не только не обладал подобным защитным действием, но даже вызывал возрастание числа поврежденных клеток в популяции. Принимая во внимание наличие специфических центров связывания тафцина на плазматических мембранах макрофагов мышей (Lipton J.M., 1997; Getting S.J. et al., 1999), можно предположить, что свои защитные свойства исследуемый имммуномодулятор реализует именно за счет связывания с собственными рецепторами.

Заслуживает внимание тот факт, что фрагмент Lys-Pro-Arg, трипептид, входящий в структуру тафцина, содержится также в таких высокоактивных нейропептидах, как субстанция Р, нейротензин, оказывающих разностороннее воздействие на регуляцию центральных функции (Gainer Ed.H., 1977). Гривенников и соавторы (1999) предполагают, что во взрослом организме тафцин способен выполнять функции нейротрофического фактора «общего» характера, например, при повреждении мозга и развитии компенсаторно-восстановительных процессов, так как иммуноглобулины G присутствуют не только в крови, но и в спинномозговой жидкости.

Полученные в данной работе результаты позволяют предполагать, что один из возможных механизмов протекторного действия тафцина в условиях ОС включает связывание с находящимися на поверхности перитонеальных макрофагов рецепторами.

Последовательность введения к клеткам Н2О2 и семакса

Проведенные нами эксперименты показали что, 45-минутная инкубация культивируемых клеток гиппокампа в растворе Хенкса после окончания 15-минутной инкубации с Н2О2 (0,5 мМ) приводила к накоплению в культуре до 50% поврежденных клеток. В аналогичных условиях в культуре клеток септума накапливалось до 70% поврежденных клеток, указывая на большую чувствительность последних к Н2О2 по сравнению с гиппокампальными культурами. Использование Н2О2 в концентрации 1мМ приводило к повреждению до 90% клеток септума. Добавление семакса (10 мкг/мл) к культурам гиппокампа и септума сразу после окончания инкубации с Н2О2 незначительно увеличивало жизнеспособность клеток.

Как оказалось однократное внесение семакса (10 мкг/мл) в среду культивирования за 24 часа до ОС существенно снижало количество поврежденных клеток, как в популяции культивированных клеток гиппокампа так и в популяции культивированных клеток септума. Сопоставление данных представленных на рис. 6

Рис.6. Выраженность защитного действия семакса при различной последовательности введения пептида и Н2О2 к клеткам.

Данные представлены в виде разницы между величиной МТТ-теста в клетках, подвергнутых действию Н2О2 в присутствии и отсутствии семакса (10 мкг/мл), (защитный эффект семакса, %). Семакс добавляли к культивируемым клеткам гиппокампа () и септума () либо на 45 мин после ОС, вызванного 15-минутной инкубацией с Н2О2, либо за 24 часа до ОС.

показывает, что защитное действие семакса от Н2О2-индуцированного повреждения мембран клеток гиппокампа и септума оказывается несколько более выраженным при его введении к клеткам за 24 часа до инициирования ОС. Можно предположить, что Н2О2-индуцированное повреждение клеток может быть опосредовано образованием NO, влекущее за собой усиление входа ионов Са+2 и последующую активацию NO-синтетаз, вызывающие деградацию клеток (Snyder et al., 1992). Взаимодействуя с супероксидом, NO образует пероксинитриты, разрушающие липиды клетки. В работе Шадриной М.И. (2001) показано, что семакс достоверно снижает уровень NO в коре мозга крысы при неполной глобальной ишемии. Данный факт может указывать на способность семакса влиять на ОС, опосредуемый NO.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»