WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Одгаева Айса Владимировна

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНОГО ПЕПТИДА СЕМАКСА НА Н2О2 ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ЖИВОТНЫХ

03.00.13 – Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Астрахань 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Каменский Андрей Александрович

Научный консультант: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Туровецкий Валерий Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник

Котелевцев Сергей Васильевич

доктор биологических наук,

доцент

Кондратенко Елена Игоревна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Защита состоится « 6 » марта 2009 года в 14-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д.1, Инновационный Естественный институт.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Инновационного Естественного института Астраханского государственного университета.

Автореферат разослан « 5 » февраля 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Ю.В. Нестеров

Введение

Актуальность проблемы. В настоящее время очевидна необходимость создания лекарственных препаратов, способных повышать эффективность умственного труда в сложных условиях, не обладающих негативными побочными воздействиями. В поисках таких средств исследователи обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или соединений, являющихся близкими их аналогами. В первую очередь внимание специалистов привлекают к себе регуляторные пептиды, воздействующие практически на все физиологические функции организма (Ляпина Л.А., Пастророва В.Е., 2006).

Одним из перспективных направлений в этой области являются работы по созданию лекарственных средств на основе аналогов фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ), в частности фрагмента 4–10 аминокислотной последовательности АКТГ(4–10). В современной клинической практике одним из самых известных клинически применяемых препаратов, созданных на основе фрагмента АКТГ в Институте молекулярной генетики РАН (Пономарева-Степная М.А. и др., 1984), является семакс. Семакс – первый российский ноотропный препарат из группы нейропептидов, имеющий ряд важных преимуществ перед известными аналогами: полное отсутствие токсических и побочных влияний, а также гормональной активности.

Имеющиеся в настоящее время в литературе данные (Сафарова Э.Р., 2003; Гривенников И.А., 2006; Сторожевых Т.В., 2007) указывают на то, что высокая фармакологическая эффективность регуляторного пептида семакса в значительной степени определяется его нейропротекторным действием, в частности, его способностью повышать устойчивость мембран клеток к действию повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют активные формы кислорода (АФК), повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний. В число АФК входит и перекись водорода, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации их действия на клетки. Одной из важных мишеней повреждающего действия Н2О2 на клетку является ее плазматическая мембрана. При этом, как полагают (Гамалей И.А., 1997), Н2О2 индуцирует в клетке развитие процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящих к нарушению целостности их плазматических мембран и, как следствие, повышению проницаемости, а в дальнейшем - клеточной гибели. Известно, что действие многих повреждающих агентов на клетки сопровождается изменением внутриклеточной концентрации ионов Н+ и свободного Са2+, что играет важную роль в формировании ответа клеток на эти воздействия и реализации их повреждающего эффекта (Литинская Л.Л. и др., 1987; Порядин Г.В., 1997). Таким образом, изучение роли рН и Са2+ в качестве модифицирующих агентов может привести нас к пониманию возможных механизмов защитного действия семакса.

В заключение следует подчеркнуть, что, несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы проблема механизмов реализации молекулярных и клеточных эффектов семакса еще далека от своего окончательного разрешения.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было изучение влияния регуляторного пептида семакса на Н2О2–индуцированные повреждения мембран перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток.

В задачи работы входило:

1.Изучение основных закономерностей повреждающего действия перекиси водорода на мембраны перитонеальных макрофагов мышей и культивируемых нервных клеток мозга крыс.

2.Изучение влияния семакса на Н2О2-индуцированное повреждение плазматических мембран иммунокомпетентных и нервных клеток.

3.Изучение влияния семакса на некоторые функционально-метаболические параметры клеток.

Научная новизна. Использован комплексный подход к изучению протекторного действия семакса при повреждающем действии Н2О2. Изучено влияние ионов водорода на защитный эффект семакса при окислительном стрессе (ОС). Выявлено влияние исследуемого регуляторного пептида на функционально-метаболическую активность фагоцитарных и нервных клеток.

Практическое значение. Исследование и внедрение в клиническую практику новых препаратов, созданных на основе регуляторных пептидов, является актуальной проблемой, обусловленной необходимостью лечения целого ряда заболеваний человека. Использованный в работе комплексный подход к изучению защитного действия семакса при инициации клеточных повреждений может быть использован в медико-биологических, клинических и фармакологических исследованиях новых синтетических препаратов.

Апробация работы. Основные положения работы представлялись на 4-м Международном симпозиуме “4th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators” (Москва – Санкт-Петербург, 2006); 20-й Международной конференции “Stress and Behavior” (Санкт-Петербург, 2007); 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); 20-м Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова. (Москва, 2007); 13-й и 14-й Международной конференции «Ломоносов», (Москва, 2006; 2007); Конференции "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга" (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 8 докладов в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками. Библиография содержит 203 названия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований. Объектами исследований служили перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей-самцов, а также клетки диссоциированных культур гиппокампа, септума и мозжечка головного мозга крыс. Культуры нервных клеток были любезно предоставлены сотрудником лаборатории «Структуры и функции митохондрий» НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ д.б.н. Исаевым Н.К., за что автор приносит ему искреннюю благодарность.

Для получения перитонеальных макрофагов мышей их забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса, содержавшего 10 мМ HEPES (рН 7,2) и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, содержавшую макрофаги. Концентрацию полученной таким образом суспензии клеток доводили тем же раствором до величины 1,5х106 клеток в мл. Небольшие объемы суспензии (20 мкл) наносили на покровные стекла, инкубировали 45 мин во влажной камере для прикрепления клеток к субстрату, а затем промывали раствором Хенкса для удаления неприкрепившихся клеток (Туровецкий В.Б. и др., 1995).

Методы исследования

Определение внутриклеточного рН макрофагов проводили с использованием варианта микрофлуориметрического метода. Введение в клетки люминесцентного рН-индикатора флуоресцеина осуществляли путем их инкубации с флуоресцеиндиацетатом (ФДА) (5 мкг/мл) течение 15 мин. После отмывки от несвязавшегося красителя проводили регистрацию интенсивности флуоресценции (I) отдельных клеток в двух узких полосах спектра излучения флуоресцеина (с максимумами в области 1=520 нм и 2=570 нм). Для определения значения внутриклеточного рН пользовались калибровочной кривой, представляющей собой график зависимости коэффициента К, равного отношению I1 к I2, от величины рН среды (Туровецкий В.Б., 1994).

Измерения проводили с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И3, оснащенного фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А с цифровым вольтметром Щ-4300. Возбуждение флуоресценции клеток осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания КГМ9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС1-4 и СЗС21-2.

Выявление клеток с поврежденной плазматической мембраной осуществляли с использованием одновременной окраски клеток флуорохромами ФДА (5мкг/мл) и бромистым этидием (ЭБ) (5мкг/мл) (Dankberg F., Persidsky M.D., 1976). В результате такой обработки уже через 15 мин инкубации клеток с флуорохромами в поле зрения люминесцентного микроскопа легко идентифицируются клетки с поврежденной и неповрежденной плазматической мембраной. Анализировали несколько полей зрения на каждом стекле (не менее 400 клеток) (Туровецкий В.Б. и др., 1995).

Оценку содержания активных форм кислорода в макрофагах проводили с использованием НСТ-теста, в основе которого лежит восстановление в цитоплазме

макрофагов красителя нитросинего тетразолия (НСТ, 0,1%-ный раствор) до нерастворимого диформазана под влиянием супероксидного аниона, который образуется в больших концентрациях при активации клетки (Кондратьева И.А., Самуилов В.Д., 2001).

Оценку уровня клеточного метаболизма определяли с помощью МТТ-теста. Для оценки уровня МТТ-теста клетки инкубировали 30 мин с МТТ (0,5 мг/мл), лизировали ДМСО и определяли оптическую плотность при =570 нм c помощью сканирующего ридера Microelisa autoreader MR 580 (Dynatech Product, Germany).

Экспериментальные клеточные модели

Окислительный стресс, индуцированный в клетках с помощью Н2О2.

ОС в перитонеальных макрофагах индуцировали при температуре 370С в течение 15 мин с помощью Н2О2, введенной в необходимых концентрациях в забуференный HEPES (10 мМ) раствор Хенкса (pH 7,2). Далее покровные стекла помещали на 45 мин в раствор Хенкса без Н2О2. Семакс и его аналог, а также исследуемые агенты добавляли в соответствующих концентрациях к клеткам сразу после окончания их инкубации с Н2О2 и отмывки от нее.

ОС в культивируемых нервных клетках индуцировали в несколько иных условиях. В ходе экспериментов с культивируемыми клетками плейты с клетками содержались в СО2-инкубаторе при температуре 370С. Оценку влияния на клетки Н2О2 и семакса проводили с помощью МТТ-теста.

Ультрафиолетовое облучение клеток.

Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги. В качестве источника ультрафиолетового облучения использовали лабораторный спектральный облучатель ЛОС-2. Облучение клеток проводили в дозах 4, 5, 6 и 12 Дж/см2 при интенсивности света 10 мВт/см2 через светофильтр с максимумом пропускания при =306 нм в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5 (Пирутин С.К. и др., 2002). После окончания облучения клетки инкубировали дополнительно 15 и 60 мин как в отсутствие добавок, так и в присутствии семакса (100 мкг/мл) или его аналога (100 мкг/мл).

Статистическая обработка результатов экспериментов

Результаты, полученные не менее чем в 5 независимых экспериментах в каждой серии, обрабатывали с помощью программы Statsoft Statistica 6.0. Данные представлены в виде средних значений исследуемых параметров и их среднеквадратических ошибок. Достоверность различий между средними значениями определяли по критерию Стьюдента. Различия между средними значениями исследуемых параметров считали достоверными при р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Повреждение плазматических мембран макрофагов при действии Н2О2

Клеточная мембрана является одной из чувствительных мишеней при действии на клетку многих повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют АФК, повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний (Капелько В.И., 2003). В число АФК входит и Н2О2, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации их действия на клетки.

Температура и время инкубации клеток с Н2О2 в разных концентрациях

Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что инкубация перитонеальных макрофагов с Н2О2 сопровождалась повышением относительного содержания в популяции клеток с поврежденной плазматической мембраной. Выраженность эффекта возрастала при повышении концентрации перекиси от 0,1 до 10 мМ. Эти результаты находятся в хорошем соответствии с литературными данными (Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993; Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996) о том что, что при действии на клетки Н2О2 в концентрации 0,1-2,5 мМ происходит комплекс событий, приводящий, в конечном счете, к ее гибели.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»