WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

НОВИКОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И БИОИНФОРМАТИЧЕСКОГО ПОДХОДОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ

В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ

генетика – 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Новосибирск, 2007

Работа выполнена в секторе молекулярной эволюции, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Блинов Александр Геннадьевич,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бородин Павел Михайлович,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук,

член-корреспондент РАН

Сергей Викторович Нетесов,

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", Кольцово, Новосибирская область

Ведущее учреждение: Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Защита диссертации состоится « _ » _______ 2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » ________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ретротранспозоны – мобильные элементы эукариот использующие в процессе перемещения процесс обратной транскрипции. Считается, что возникновение ретротранспозонов по времени совпадает с возникновением эукариот (Malik et al. 1999). Эти мобильные элементы найдены практически у всех эукариот, принадлежащих к различным таксономическим группам, таким, как микроорганизмы, грибы, животные и растения. Перемещение мобильных элементов, в частности ретротранспозонов, оказывает серьезное влияние на геном, например, вызывает многие известные фенотипические мутации у Drosophila melanogaster, а также некоторые генетические болезни человека. Из-за их перемещения может происходить дестабилизация генома, проявляющаяся в виде гибридного дисгенеза и геномных перестроек.

Несмотря на важность проблемы, в картине происхождения мобильных элементов остаются нерешенные вопросы. Особый интерес представляют исследования эволюции и распределения различных групп мобильных элементов среди эукариотических организмов, а также системы взаимодействия мобильный элемент – геном-“хозяин”. Частичное решение этого вопроса возможно при исследовании широкого круга эукариот экспериментальными и биоинфоматическими методами. Экспериментальные подходы дают исследо-вателю возможность выбирать практически любой объект, тогда как биоинфор-матический анализ геномных последовательностей позволяет осуществить поиск всех мобильных элементов, присутствующих в геноме.

Скорпионы (Arachnida: Scorpiones) относительно небольшой отряд хелицеровых, насчитывающий около 2000 видов и 180 родов (Soleglad et al. 2005). Отряд скорпионов представляет большой интерес для эволюционных биологов, так как является одним из древнейших отрядов сухопутных членистоногих (Brownell and Polis 2001). Исследования ретротранспозонов представителей такой малоизученной группы как отряд скорпионов могут дать ответы не только на вопросы эволюции и распределения ретротранспозонов внутри данной группы, но и помочь в решении вопросов происхождения и разнообразия ретротранспозонов у членистоногих.

Бабочки-голубянки рода Maculinea являются одним из интересных объектов изучения для экологов. Представители рода Maculinea – мирмекофилы, на последних стадиях гусеницы этих бабочек живут в муравейнике. Исследования ретротранспозонов Maculinea могут дать информацию не только об эволюции этой группы мобильных элементов у бабочек, но и могут быть полезны для популяционных биологов и экологов для решения вопросов сохранения биоразнообразия.

С установления полной нуклеотидной последовательности генома человека началась так называемая постгеномная эра развития биологии. Доступность полных геномных последовательностей многих эукариот дает возможность для исследования разнообразия ретротранспозонов при помощи компьютерных методов (анализ in silico). Геномы грибов относительно небольшие (Woestemeyer and Kreibich 2002), что делает их очень удобным объектом для геномных исследований. In silico анализ малых геномов требует меньше времени и ресурсов, а значит использование небольших геномов имеет преимущества при проверке правильности и эффективности выбранного подхода. Кроме того, грибы содержат небольшую, но очень разнообразную, фракцию повторенных последовательностей, в том числе и ретротранспозонов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение распространения и эволюции ретротранспозонов в геномах эукариотических организмов при помощи экспериментальных и биоинформатических подходов.

В конкретные задачи работы входило:

  1. Исследование разнообразия non-LTR ретротранспозонов среди представителей отряда Scorpiones (Arachnida: Scorpiones) и представителей рода Maculinea (Lepidoptera: Lycaenidae).
  2. Определение нуклеотидных последовательностей элементов, относя-щихся к различным группам non-LTR ретротранспозонов, из видов отряда Scorpiones и рода Maculinea.
  3. Обработка последовательностей, изучение внутри- и межвидовой вариа-бельности, оценка разнообразия групп non-LTR ретротранспозонов в геномах видов отряда Scorpiones и рода Maculinea. Построение филогенетических деревьев non-LTR ретротранспозонов.
  4. Исследование разнообразия LTR ретротранспозонов с помощью биоинформатических подходов в геномах семи эукариотических организмов, включая два вида грибов (Fungi) и пять видов животных (Animalia).
  5. Исследование разнообразия и получение полных последовательностей LTR ретротранспозонов из геномов Aspergillus fumigatus и A. nidulans (Fungi: Ascomycota). Анализ нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических деревьев LTR ретротранспозонов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые было проведено исследование распространения, разнообразия и эволюции non-LTR ретротранспозонов в геномах представителей отряда Scorpiones и бабочек рода Maculinea. Полученные данные позволили выявить существование большого разнообразия линий non-LTR ретротранспозонов различных филогенетических групп у членистоногих, на примере представителей отряда Scorpiones и рода Maculinea. Обнаружен уникальный случай горизонтального переноса non-LTR ретротранспозона между бабочками семейств Bombycidae и Lycaenidae. На сегодняшний день описанный в данном исследовании случай горизонтального переноса является вторым доказанным случаем межвидового переноса non-LTR ретротранспозонов.

Совместно с программистами компании UniPro (Новосибирск) был разработан биоинформатический подход для поиска мобильных элементов в геномных последовательностях. Использование этого подхода позволило выявить разнообразие LTR ретротранспозонов в геномах грибов – Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans. Впервые было проведено исследование мобильных элементов на предмет наличия признаков гомолог-зависимой инактивации повторенных последовательностей в масштабах целого генома.

Обнаруженные ретротранспозоны могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров для дальнейших популяционных исследований. В частности, LTR ретротранспозоны могут быть использованы как маркеры для микробиологического мониторинга A. fumigatus, основного возбудителя аспергиллеза, в условиях современных лечебно-профилактических учреждений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 4-ой и 5-ой конференциях “Биоинформатика регуляции и структуры генома” (BGRS’2004, Новосибирск, 2004; BGRS2006, Новосибирск, 2006), на EMBO конференции “Молекулярные механизмы транспозиции, их регуляция и эволюция” (Роскоф, Франция, 2004), на конференции “Исследования экологии и охраны бабочек в Европе” (Лайпциг-Халле, Германия, 2005), на Международной молодежной научно-методической конференции “Проблемы молекулярной и клеточной биологии” (Томск, Россия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 8 работ и 2 приняты в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 148 страницах печатного текста, содержит 18 таблиц и иллюстрирована 57 рисунками. В списке литературы приведено 279 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение ДНК. Образцы Scorpiones были предоставлены доктором В. Фетом (Marshall University, USA). Личинки Maculinea были собраны E. liwiska (Jagiellonian University, Poland), имаго других Lepidoptera были любезно предоставлены к.б.н. О. Костериным (Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия) и д.б.н. В. Дубатоловым (Институт систематики и экологии животных СО РАН, Россия). Выделение тотальной ДНК осуществлялось согласно описанному протоколу (Sunnucks and Hales 1996).

ПЦР-амплификация, клонирование, секвенирование. При амплификации использовался стандартный протокол и описанные праймеры (Glushkov et al. 2005; Novikova et al. 2007). Клонирование осуществлялось согласно инструкции в векторе pGEM-T (Promega), определение нуклеотидной последовательности проводилось при помощи автоматического секвенирования с использованием реагента BigDye Terminator Ready Reaction Mix v.3.0 (Applied Biosystems).

Компьютерный анализ последовательностей. Множественное и попарные выравнивания полученных последовательностей осуществлялось при помощи программ ClustalW (Thompson et al. 2004). Филогенетические деревья были построены методом соединения ближайших соседей (NJ – Neighbor Joining) при помощи программы MEGA3.0 (Kumar et al. 2001). Для оценки достоверности топологии использовался бутстрэп-тест (Felsenstein 1985).

Анализ последовательностей геномов. Для анализа последовательностей геномов использовалась программа UniPro GenomeBrowser. Для поиска аминокислотных последовательностей совместно с программистами компании UniPro (Новосибирск) были разработаны приложения HMM (hidden Markov model) и Find ME,, алгоритм которых основан на использовании скрытых цепей Маркова (Eddy 1998). Программа UniPro GenomeBrowser и приложения доступны на веб-сайте: http://genome.unipro.ru/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Non-LTR ретротранспозоны в геномах представителей отряда Scorpiones.

Проведенный анализ 22 видов скорпионов, относящихся к двум обширным подотрядам Buthida и Iurida, показал необычно высокое разнообразие non-LTR ретротранспозонов, присутствующих в геномах этих беспозвоночных. При помощи ПЦР скрининга было выявлено наличие четырех филогенетических групп (R1, CR1, Jockey и I), присутствие трех из них было подтверждено при помощи клонирования, секвенирования и сравнительного анализа полученных фрагментов. Помимо всего прочего, был проведен филогенетический анализ полученных фрагментов (рис. 1).

Рис. 1. Филогенетический анализ полученных фрагментов обратной транскриптазы для филогенетической группы CR1 из Scorpiones. Выделены три линии CR1-подобных элементов.

Подавляющее большин-ство полученных фраг-ментов обратной транс-криптазы для всех исследованных филогене-тических групп оказались фрагментами нарушенных мобильных элементов. Можно предположить, что обнаруженные элементы либо очень редко перемещаются в геномах скорпионов, либо вообще не перемещались последнее время.

Неожиданное разнообразие различных линий non-LTR ретротранспозонов было обнаружено внутри филогенетических групп CR1 и Jockey. Внутри группы Jockey согласно результатам филогенетического анализа по меньшей мере четыре линии ретротранспозонов, эволюционные отношения между которыми на данном этапе остались неразрешенными. Одна из линий внутри СR1 группы оказалась ближе к мобильным элементам позвоночных, чем беспозвоночных (рис. 1, кластер I). Долгое время считалось, что членистоногие представлены внутри филогенетической группы CR1 только элементами T1Q семейства. Однако, данное исследование показывает, что разнообразие семейств CR1-подобных элементов членистоногих гораздо больше.

Non-LTR ретротранспозоны в геномах представителей рода Maculinea.

Для поиска non-LTR ретротранспозонов в геномах бабочек рода Maculinea были выбраны четыре вида, наиболее распространенных на территории Европы: Maculinea teleius, M. nausithous, M. alcon и M. arion. При помощи ПЦР скрининга было выявлено наличие трех филогенетических групп (CR1, Jockey и R4), присутствие четырех филогенетических групп (R1, CR1, Jockey и R4) было показано при помощи клонирования, секвенирования и анализа полученных фрагментов.

Рис. 2. Филогенетический анализ полученных фрагментов обратной транскрпитазы для филогенетической группы CR1 из Maculinea.

Филогенетический анализ CR1 элементов Maculinea поз-волил выявить наличие трех семейств: MacCR1A, MacCR1B и MacCR1C (или T1Q) (рис. 3). Сравнение нуклеотидных после-довательностей показало в среднем 73.5% сходства между MacCR1A и MacCR1B. Однако, при сравнении аминокислотных последовательностей сходство было гораздо выше и составляло в среднем около 88%. Это означает, что элементы, отно-сящиеся к разным семействам, должны иметь отличный друг от друга кодонный состав.

Cосуществование двух се-мейств, достоверно различимых, но филогенетически очень близ-ких друг к другу, является интересным фактом с точки зрения возникновения новых семейств non-LTR ретротранспозонов в геномах (Eickbush et al. 1997), и может быть объяснено при помощи горизонтального переноса. В частности, различие в частотах используемых кодонов между мобильными элементами, а также между мобильными элементами и геномом организма-“хозяина”, являлось одним из первых аргументов в пользу существования горизонтального переноса мобильных элементов (Shields and Sharp 1989).

Горизонтальный перенос CR1B элементов.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»