WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 |

Разработкамоноклональных антителпротив гетеродимера CL/RAMPчеловека.

Моноклональныеантитела противгетеродимера CL/RAMPбыли выращеныпротив
нативного эпитопа сиспользованием метода

генетическойиммунизации. Позитивный моноклон LCNL-Clone 6 был использован для:

(А)сравнительного анализас использованием поликлональных антител LN-1436 выращенных нами против внутриклеточногокарбокси-окончания рецептора (см.Рис. 8) и

(Б) для блокированиядействиялигандов. Моноклональныеантитела распознают толькорецептор экспрессированныйна поверхности клетки (зеленые стрелки), вто время как поликлональные антителараспознают как рецептор наплазматической мембране (белые стрелки), таки в эндоплазматическом ретикулуме (короткие белыестрелки). (Б) Применениемоноклональных антител противгетеродимера CL/RAMPin vitro приводят к разрушению монослояэндотелиальных клеток (ЭК). Монослойэндотелиальных клеток в культуре окрашен сиспользованием красителя calcein-AM.

Таблица 4.

Специфические инеспецифические модуляторы эффектовиндуцированных адреномедуллином.

Основано налитературном источнике Nikitenko et al., 2006.

Побочные эффекты

или недостатки

Тест не проведен

Вазодилатация in vivo

Вазоконстрикция

Мишень

Лиганд (AM)

Реактив/вещество

Рибозим против АМмРНК

AMBP-1(связывающий белок)

Блокирующие антителапротив АМ

Позитивныенепептидные

регуляторы Негативные непептидные

регуляторы

Образ действия

Биологическая

активность

Деградация AM мРНК

Аффиность к

рецептору

не изменена

Защите пептида

от деградации

протеазами

Ингибирование

активности АМ

Связывание с АМСвязывание с АМ

Анти-ангиогенный

потенциал

Тест не проведен

Отсутствие

направленной

доставки

Тест непроведен Тест непроведен

Уменьшенное

количество

сосудов в

ксенографтных опухолях

Тест не проведен

Тест не проведен

Рецептор

Фрагменты пептидов:AM22-52 (антагонист

рецептора)

CGRP8-37(антагонист

рецептора)

Блокирующие антителапротив CL

Блокирующие антителапротив RAMPs

Конкуренция с

лигандом

за связывание с

рецептором

Предполагаемое

Прямое взаимодействие с рецептором

ПредотвращаетКороткая half-life неоваскуляризацию

Ингибирует

миграцию и

формирование

капиллярной сети

HUVEC

Короткая half-lifeТест не проведен Тест не проведен Тест непроведен

Антитела против Прямое взаимодействие Ингибирует

нативногокомплекса с рецептором Тестне проведен функцию

Сигнальные

каскады

(вторичные

мессенджеры)

Неизвестные

CL/RAMP

wortmannin(ингибитор

PI3K)

PD98059(ингибитор

MAPK)

Винбластин

экспрессированным на поверхности клетки эндотелия

Предотвращаетангиогенез

ИнгибированиефосфорилированияНеспецифическое

вызванноголигандомНеспецифическое in vitro и invivo

Предотвращает
Неизвестно Неспецифическоеформирование

капилляров

индуцированное

АМ

ВЫВОДЫ

  1. Путем использования лектинаUlex Europeus Agglutinin 1 (UEA1),связанного с магнитнымишариками, разработаныметоды выделения чистых популяцийэндотелиальных клеток микроциркуляторного руслаэндометрия и миометрия матки человека, какорганов в которых происходятпроцессы физиологического ангиогенеза, атакже методы культивирования первичныхкультур данных клеток, позволяющие изучатьроль ангиогенных и других факторов в ихбиологии.
  2. Доказана роль нового ангиогенногофактора адреномедуллина в биологии эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека путемдемонстрации его влияния напролиферацию и миграцию этих клеток, атакже ингибирование апоптоза и регуляцию проницаемостиэндотелиального монослоя.
  3. Клонированы и охарактеризованыпромотер и новые гетерогенные транскриптыCALCRL геначеловека, а также разработан методопределения трехмерной субхромосомнойструктуры генов. Показано, что экспрессияCALCRL геназависит прежде всего от клеточно- иткане-специфического фона. При этомключевым фактором экспрессии CALCRL гена является еготрехмерная структура, а активностьпромотера играет вторичную роль.Продемонстрированы влияние гипоксии на активность промотераCALCRL гена человека и роль онкогенноговируса саркомы Капоши наэкспрессию CL рецептора вэндотелиальных клетках микроциркуляторного руслачеловека.
  4. В экспериментах с использованиемпервичных клеточных культур и тканейчеловека и разработанныхплазмидных векторов, позволяющихпроизводить зонды для гибридизации in situ иNorthern блоттинга, показана специфическаяэкспрессия CALCRL гена человека иCL рецептора вэндотелиальных клеткахмикроциркуляторного русла in vitro и invivo.
  5. Впервые определены функциональныесвойства G-белок связывающегорецептора CL
    экспрессированного в тканях иэндотелиальных клеткахмикроциркуляторного русла
    человека.

    Продемонстрировано, чтоименно CL рецептор непосредственновзаимодействует
    садреномедуллином и осуществляет рольрецептора для данного пептида вэндотелии

  6. человека, обеспечивая работуизвестных до настоящего моментасигнальных каскадов ассоциированных состимуляцией эндотелия адреномедуллином. Вэкспериментах по изучению интернализациирецептора с использованием антагонистовАМ и CGRP рецепторов показано, что CL рецептортакже играет роль CGRP рецептора в эндотелиальныхклетках микроциркуляторного руслачеловека.
  7. Продемонстрировано, чтоизбыточная экспрессия одного или другоголиганда (АМ либо
    CGRP)приводит к потере функции (десенситизации)эндотелиального CL к обоим
    лигандам, и поэтому может игратьроль при развитии сердечно-сосудистыхзаболеваний
    различнойэтиологии. При этом десенситизациярецептора обусловлена его
    интернализацией только в случаевзаимодействия с АМ.
  8. Разработаныполиклональные антителапротив человеческого CLрецептора и продемонстрированаих способность распознаватьдегликозилированный,основногликозилированный итерминально-гликозилированные формырецептора, а также возможность их использования дляопределения локализации рецептора вклетках человека in vitro и in vivo.
  9. Впервые продемонстрированаэкспрессия CL рецептора в тканях человека внорме и при патологии (напримере опухолевых тканей почек, яичников,лейомиомы и саркомы Капоши).Показано, что в раковых опухолях рецепторможет быть экспрессирован либо только в эндотелиальных клетках(лейомиома и саркомы Капоши), либо вэндотелиальных клетках и в раковых клетках(опухолевые заболевания почек и яичников).Впервые выявлена необходимостьисследования фармакологииадреномедуллиновых рецепторов как вэндотелиальных клетках опухолей, так и всамих опухолевых клетках; атакже необходимость выявления различийсвойств CL рецептораэкспрессированного в нормальном иопухолевом эндотелии.
  10. Показано, чтосуществует корреляция между экспрессиейлиганда, либо его рецептора,и развитием/прогрессированием опухолевыхзаболеваний человека. Выявлено, что в опухолевых тканях экспрессиярецептора в раковых клетках может бытьассоциирована с появлениемраковых клеток в сосудахмикроциркуляторного русла.
  11. Продемонстрировано, что онкогенныевирусы (например, вирус саркомы Капоши)обладают способностью регулироватьэкспрессию CL рецептора в эндотелиальныхклетках микроциркуляторного руслачеловека. Сконструированная лентивирусная«библиотека» позволилавыявить индивидуального вирусного гена К2(кодирующего vIL6) в регуляцииэкспрессии CL рецептора. Полученные данныевпервые указывают на необходимость дальнейшегоизучения роли адреномедуллиновыхрецепторов в трансформированном вирусомэндотелии человека и выявление различийсвойств CL рецептораэкспрессированного в нормальном итрансформированном вирусомэндотелии.
  12. Получены моноклональные антителапротив гетеродимера CL/RAMP, экспрессированного на поверхностиклетки, и показана возможность ихиспользования длярегуляции свойств эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека,указывает на возможность ихприменения в качестве эффективного методакоррекции патологий, связанных с функциейадреномедуллиновых рецепторов, какнапример патологическийангиогенез и гиперпроницаемостьэндотелия.
  13. Экспрессия адреномедуллиновыхрецепторов на ранних стадиях эмбриогенезаи дифференцировки стволовых клеток вовзрослом организме указывает на ихвозможную роль в процесседифференцировки клеток человека.
  14. Впервые выявлены и обобщены рольмногоступенчатой регуляцииспецифической

экспрессии и функциональныхсвойств CL рецептора в биологииэндотелиальных клеток внорме и при патологии 4).

Список научных работопубликованных по теме диссертации

  1. Oehler MK, Nikitenko LL, Hague S,Bicknell R, Rees MCP. Expression of the angiogenic growth factor adrenomedullin in endometrial carcinoma cell linesand endometrial adenocarcionoma. Xth HamburgSymposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany – 1999. – P. 112.
  2. Oehler MK, Nikitenko LL, HagueS, Bicknell R, Rees MCP. Prognostic relevance of serum vascular endothelial growth factor in ovarian cancer. // XthHamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany. – 1999. – P. 128.
  3. Nikitenko LL, MacKenzie IZ, ReesMCP, Bicknell R. Adrenomedullin is an autocrine regulator of endothelial growth in human endometrium. // Molecular HumanReproduction. – 2000.– Vol. 6 (9). – P.811-819.
  4. Nikitenko LL, Lloyd BH, RudlandPhS, and Barraclough R. Localisation by in situ hybridisation of S100A4 (p9Ka) mRNA in primary human breast tumour specimens.// International Journal of Cancer.
    – 2000. – Vol. 86. – P. 219-228.
  5. Nikitenko LL, MacKenzie IZ,Bicknell R, Rees MCP. Adrenomedullin/CGRP receptors in the human uterus. // XIth International Congress of Histochemistryand Cytochemistry, York, United Kingdom. – 2000. – P. 234.
  6. Nikitenko LL, MacKenzie IZ, ReesMCP, Bicknell R. Isolation, culture and growth factor responsiveness of humanendometrial endothelium. // Annual ICRF Colloquium, Warwick, UnitedKingdom– 2000. – P.54.
  7. Nikitenko LL, MacKenzie I, ReesMCP, Bicknell R. Adrenomedullin is an autocrine regulator of endothelial growth in human endometrium. // Introduction toMolecular and Cellular Research, San-Diego, USA.– 2000. – P. 97.
  8. Nikitenko LL, Brown NS, SmithDM, MacKenzie I, Bicknell R, Rees MCP. Differential and cell-specific expression of calcitonin-receptor-like receptor andreceptor activity modifying proteins in the human uterus. // Molecular HumanReproduction. – 2001.– Vol. 7(7).– P.655-664.
  9. Nikitenko LL, Smith DM, Hague S,Wilson CR, Bicknell R, Rees MCP. Adrenomedullin and the Microvasculature. // Trends in Pharmacological Sciences.– Vol. 23(3).– P.101-103.
  10. Rees MCP, Nikitenko LL, HagueS, Bicknell R. Endometrial angiogenesis. In: Maruo T, Barlow D, Mardon H,Kennedy S. (eds) Cell and Molecular Biology of Endometrium in Health andDisease. Soeshi Publishing. – 2002. – P. 145-155.
  11. Wilson CR, Nikitenko LL, SmithDM, Sargent IL, Rees MCP. Expression of adrenomedullin and its receptors in placenta and decidua. // 8th IFPA Meeting,Melbourne, Australia. – 2002. – P. –121.
  12. Nikitenko LL, Patel S, ClissoldP, Rees MCP, Bicknell R. Molecular characterization of the adaptive response of endothelial cells to hypoxia. //Angiogenesis: basic mechanisms and therapeutic implications, Ascona,Switzerland. – 2002.– P. - 27.
  13. Nikitenko LL, Rees MCP,Bicknell R. Adrenomedullin signalling system and microvascular endothelial cellresponse to hypoxia. 5th Imperial College School of Medicine Symposium“Vascular endothelium: Role in disease pathogenesisand as a therapeutic target”. // London, United Kingdom. – 2002. – P. 18.
  14. Nikitenko LL, Smith DM,Bicknell R, Rees MCP. Transcriptional regulation of human CRLR in microvascular endothelial cells. // 676th Biochemical SocietyMeeting, Heriot-Watt University, Edinburgh, UnitedKingdom. – 2002.– P. 81.
  15. Nikitenko LL, Smith DM,Bicknell R, Rees MCP. Transcriptional regulation of the CRLR gene in human microvascular endothelial cells by hypoxia. // TheFASEB Journal. – Vol.17(11). – P.1499-501. Full-length article is available at: http://www.fasebj.org/cgi/reprint/02-0993fjev1.pdf
  16. Nikitenko LL. Molecularmechanisms of the adaptive response of endothelial cells to hypoxia. // 6thInternational Engelhardt Conference on Molecular Biology, Москва и Санкт Петербург, Российская Федерация. – 2003. – P. 17.
  17. Nikitenko LL, Smith DM,Bicknell R, Rees MCP. Mechanisms of transcriptional regulation of GPCR CRLR in the microvasculature. // Special FEBS 2003 Meetingon Signal Transduction, Brussels, Belgium. EJB TheFEBS Journal. 2003. - Vol. 270(1). - P. 49.
  18. Patel S, Nikitenko LL, TerretJ, Bicknell R. Identification of hypoxia inducible messengers expressed inhuman dermal microvascular endothelial cells. // The 40th American Associationfor Cancer Research Annual Meeting, New Orleans, USA.– 2003. – P. 270.
  19. Wilson CR, Nikitenko LL,Sargent IL, Rees MCP. Adrenomedullin: multiple functions in human pregnancy. // Angiogenesis. – 2004. – Vol. 7(3). – P. 203-12.
  20. Nikitenko LL. Heterogeneity ofnovel CRLR transcripts in human microvascular endothelial cells. JointInternational Symposium on CGRP, Amylin and Calcitonin 4th Symposium on Adrenomedullin and Proadrenomedullin N-20 Peptide, Zurich,Switzerland. – 2004.– P. 21.
  21. Pathak H, Staff AC., Harsem NK,Braekke K, Sargent I, Rees MCP, and Nikitenko LL. Adrenomedullin expression in the decidua in normal andpre-eclamptic pregnancy. XXXIV Congress of NordicFederation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland.– 2004. – P.58.
  22. Carroll VA, Nikitenko LL,Bicknell R., Harris AL. Antiangiogenic activity ofa domain deletion mutant of tissue plasminogenactivator containing kringle 2. // Arteriosclerosis, Thrombosis andVascular Biology. – 2004. – Vol. 25(4). – P. 736-41.
  23. Nikitenko L.L. Embryonicdevelopment: Tutorials for biomedical students. // Collection MCQ. Keble College, Oxford, United Kingdom. – 2005. – 24 P.
  24. Wilson J, Pathak H, Staff AC,Harsem NK, Braekke K, Rees MCP, Sargent IL, Nikitenko LL. Expression of adrenomedullin and its receptor in third trimesterplacental bed decidua from normal and pre-eclampticpregnancies. // XI European Placenta Group Meeting, Glasgow, United Kingdom.– 2005. – P.
    Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»