WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |

CancerProfiling Array (кДНК блот) состоит изнормализованных парныхкДНК образцов полученных изобщей РНК из 13 органов. Каждая пара состоит из опухолевого(О) образца и нормальной (Н)ткани полученных из одногои того же пациента. ПарнаякДНК представляет собой общее количество мРНКэкспрессированной в даннойткани. Блот был использовандля получения данных окорреляции экспрессии гена адреномедуллина (АМ) c развитиемопухоли. кДНК АМ иубиквитина были клонированы в вектор дляполучения зондов. Зондыбыли помечены 32Р-дЦТФ. Cancer Profiling Array иРНК Northernблот были последовательнопрогибридизированы с каждым из зондов всоответствии с разработанными намиметодами (Nikitenko et al., 2001). После гибридизации, промывки иэкспозиции блотов, радиоактивный сигнал былзарегистрирован с использованием X-Rayпленки и измерен с помощью PhosphoScreen и ImageQuant Software. После этого зондбыл удален и проведена гибридизация споследующим зондом.Отношение АМ/Убиквитин было рассчитанодля определения относительного уровняэкспрессии мРНК. Специфичность зондов былапроверена с помощью Northern блоттинга.Экспрессия АМ была повышенатолько в трех видах опухолей, при этомсамая большая разница была обнаружена сопухолях почек (выделено штриховой линией). Статистический анализ былпроведен с использованием тестаВилкоксона (Р=0.0067).

Нами была выдвинутагипотеза о том что экспрессия АМ и CL могутявляться факторами прогнозаразвития раковых опухолей [Nikitenko et al., 2006].Проведенные в течение последних двух лет исследования внашей и других лабораториях показали, чтосуществует корреляция междуэкспрессией лиганда либо его рецептора иразвитием либо прогрессированием опухолевыхобразований в определенных органах человека [Ucaret al., 2006;Pavel et al., 2006; Michelsen et al., 2006].

Исследованиеэкспрессии функционального CLрецептора и его локализации враковых тканях человека

Поскольку исследованияпроведенные в нашей лаборатории указывалина то, что экспрессия АМповышена в опухолевых тканях почек,яичников, лейомиомы и саркомы Капоши, мы изучилиэкспрессию адреномедуллиновых рецепторовв этих тканях. Экспрессия АМ регулируетсявоспалительными цитокинами и гипоксией.Гипоксия является обычным показателем микроокруженияопухолей и одной из основных причин роста ипрогрессии раковыхопухолей [Harris, 2002], и поэтому роль АМ как промотераданных процессов путем индуцирования ангиогенеза былапредложена для многих опухолевыхзаболеваний включая лейомиому [Nikitenko et al., 2006]. В то же время экспрессияадреномедуллиновых рецепторов в опухолевых тканях до настоящеговремени оставалась неизученной [Nikitenko etal., 2006].Поэтому мы изучили какиеклетки экспрессируют адреномедуллиновыерецепторы в опухолевых тканях на примерепочек, яичников, лейомиомы и KC.

Экспрессия CL в раковыхопухолях почек

Рак почек (РП)составляет 2% раковых заболеваний [http://www.cancerresearchuk.org].Пятилетняя статистикавыживаемости – 40.5% [Campaign, 2001], прежде всего из-за метастазовкоторые происходят у 75%процентов пациентов [Dawson and Whitfield, 1996].Конвенционная химиотерапиялибо иммунотерапия у данных пациентовприводит к ответу всего лишь у 10% процентовданных пациентов [Cancer: Principles and Practice of Oncology, 2001; Godley andStinchcombe, 1999].Основной проблемой при РПявляется диагностика и предсказание течения заболевания.Наиболее эффективным показателем являетсястадия развития. Другиепоказатели, как например, гистология истепень являются менее значительными приопределении и предсказании исхода.

Экспрессия АМ мРНКбыла предварительно изучена при РП, ноданные являлись очень немногочисленными [Fujitaet al., 2002; Takahashi et al., 2002]. Исследования,проведенные Fujita и коллегами (2002)указывали на корреляцию экспрессии АМ иваскуляризацией опухолевых тканей, однаконезначительное количество тканей былоиспользовано для проведениядостаточной статистической обработкиполученных данных. В то же время данные оадреномедуллиновых рецепторах икорреляции их экспрессии с прогрессомразвития опухолейоставался неизученным. Прежде всего этобыло обусловлено отсутствием антител против адреномедуллиновогорецептора (CL).

Разработанные намиспецифические поликлональные антителапротив CL человека (Рисунок 8)позволили провести подобного родаисследования. Прежде всего нами былопоказано, чтоэкспрессированный в опухолевых тканяхрецептор терминально гликозилирован(Рисунок 10) и поэтому представляет собойфункциональную форму рецептора (экспрессированного наповерхности клетки). Кроме того, нами былииспользован

микрочип содержащийзначительное количество (180 пар) опухолевыхи нормальных тканей почек(TMA, tissuemicroarray)для изучения экспрессии илокализации CL методом иммуногистохимии (Рисунок 20). Вопухолевых тканях рецептор экспрессированкак эндотелиальными, так и опухолевымиклетками (Рисунок 20). Экспрессия CL вопухолевых клеткахзначительно повышена по сравнению снормальными эпителиальными клетками(Рисунке 20) и коррелирует споказателями выживания пациентов.

Экспрессия CL рецепторав нормальных и опухолевыхтканях почек.

Подобно Cancer Profiling Array(см. Рисунок 19), Multiple tissue array (MTA) состоит из гистологическихобразцов тканей полученныхиз парных опухолевой и нормальной тканиполученных от одного и того же пациента. Образцы (кол-во 180 пар;источник – архивы The Department ofCellular Pathology, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK) были зафиксированы в формалине игистология подтверждена патогистологами.МТА было составлено с использованием цилиндрическихобразцов диаметром 2м. Полученные таким образом образцыбыли смонтированы на блоки, с которых былипроизведены гистологические срезы,содержащие от 60 до 100 образцов тканей. Срезы былииспользованы для иммуногистохимии сприменением выращенных нами антителпротив CL (см. Рис. 34). МТА былиспользован для получения данных олокализации рецептора в нормальных иопухолевых тканях и исследования уровняего экспрессии. Рецептор локализованпреимущественно в эндотелии клубочков в нормальной ткани(стрелки) и его экспрессия повышена вопухолевых клетках. Иммунореактивность CL былаизмерена полуколичественным методом вопухолевых клетках и проведено сравнение с нормальнымиэпителиальными клетками почек.

Экспрессия CL в тканяхлейомиом

Лейомиомы матки – опухолевыеобразования в миометрии. Данные неоплазмывстречаются у трети женщин и являютсязначительной причиной возникновениякровотечений, болей,бесплодия и спонтанных абортов [Flakeet al., 2002]. В настоящее время наиболее распространенным методомлечения фиброидов является хирургическоевмешательство и данныеопухоли являются обычнымпоказателем для гистерэктомии. Существующее мнение о том, чтопатологический ангиогенез являетсязначительным фактором впроцессе развития и прогрессивногороста лейомиом. Экспрессия известныхангиогенных факторов, какнапример VEGFи bFGF былазарегистрирована в лейомиомах и предложена их роль в ангиогенныхпроцессах. Тем не менее было показано чтосреди всех изученныхангиогенных факторов, экспрессия толькоАМ, но не других факторов, коррелирует с количествомсосудов микроциркуляторного русла миометрия и индексом пролиферации эндотелия приразвитии лейомиом [Hague et al., 2002]. Тем не менее анализ экспрессии АМ и его рецепторов втканях лейомиом и миометрия матки одного итого же пациента не былпроведен. Необходимость данного родаисследований обусловлена потенциальной возможностьювоздействия на сосудистую системулейомиом без побочных эффектов на окружающий миометрий.В связи с этим нами были проведеныисследования экспрессии АМ,CALCRL и RAMPs мРНК, а такжелокализации CL рецептора в парных тканях лейомиомы и миометрияполученных от одного и того же пациента(Рисунок 21).

Экспрессия CL втканяхнормального миометрия илейомиомы.

(А) Экспрессия CL былаисследована
методомдвойной иммуногистохимии с
использованиемполиклональных антител противрецептора и моноклональныхантител против
специфических маркеров разныхтипов клеток: CD31 (эндотелиальныеклетки),CD45 (лейкоциты) иSMA(гладкомышечные клетки).Вторичные
антитела былимечены ФИТЦ либо ТК
(техасским красным) соответственно.Клетки экспрессирующиерецептор и один из маркеров определены поналичию желтой окраски после
соединения двух фотографий.

(Б)Экспрессия CALCRL и RAMPsмРНК в
тканях лейомиомы (Л) иокружающих тканях миометрия (М) былаопределена сиспользованием метода Northern blotting. Убиквитиновый зонд был
использован в качествеконтроля. Соотношение экспрессии CALCRL и RAMPs к экспрессииубиквитина отражает относительное содержание РНК всоответствующих тканях.

(В) Срезы тканейсодержащих как опухоль (лейомиома; Л) таки окружающуюткань миометрия (М) были окрашены

иммунгистохимически с использованием антител противCD34 - маркера эндотелиальных клеток и,соответственно, сосудов. Подсчетколичества сосудов былпроизведен с использованием метода «горячихточек» Chalkleycounting [Fox and Harris, 2004; Hague et al., 2001; Nikitenko et al., 2006]. Результаты анализа показываюткорреляцию CL и RAMP2мРНК и количества микроциркуляторныхсосудов в тканях лейомиомы и окружающегомиометрия.

Нами была выявленаспецифическая экспрессия CL рецептора вэндотелиальных тканях каклейомиомы так и окружающего миометрия(Рисунок 21). Следует заметить, что данныерезультаты отличаются отраспределения рецептора в опухолевыхтканях почек (Рисунок 20). Экспрессированныйв эндотелиальных клетках тканей лейомиомыCL является терминально гликозилированным, а поэтому– функциональноактивным (ассоциированным с экспрессиейна поверхности клетки)(Рисунок 21). Кроме того, экспрессия CLпонижена в тканях лейомиомы, что связанопрежде всего с уменьшением количествасосудов микроциркуляторного русла вданной опухоли (Рисунок 21). Принимая вовнимание то, что АМ играетроль в биологии эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла миометрия[Nikitenko etal., 2006],нами было выдвинутопредположение о том, что для эффективной терапии с применением ингибиторовАМ и его рецепторов для лечения лейомиомнеобходимо дальнейшее изучение различийадреномедуллиновых рецепторов экспрессированных в эндотелиинормального миометрия и тканейлейомиом для выявления потенциальных различии иэффективной терапии избегающей побочныхэффектов [Nikitenko et al., 2006].

Экспрессия CL в клеткахсаркомы Капоши

В связи с тем что намибыла обнаружена повышенная экспрессия CL вКС - опухоли, связанной странсформацией эндотелиальных клеток приинфекции онкогенным вирусом KSHV (Рисунки 15 и 16). Нами была изученаэкспрессия рецептора в тканях КС сиспользованием метода иммуногистохимии.Результаты проведенных исследованийпоказали, что веретенообразные клеткиопухоли экспрессируют CL (Рисунок 15). Дополнительно проведенныеисследования in vitroс использованиемэндотелиальных клеток микроциркуляторного руслачеловека (Рисунок 15) указывают на то, чтовирус увеличивает экспрессию рецептора винфицированном эндотелии. Учитывая то, чтоАМ является ангиогенным фактором, намибыла выдвинута гипотеза о возможной ролиАМ в аберрантном ангиогенезе при развитииКС [Fliss et al., 2006].

Таким образом, врезультате проведенных нами исследований,была впервые изучена экспрессияфункциональной формы CL рецептора вопухолевых тканях почек, лейомиомы иКС, а также локализацияданного G-белок связывающегорецептора. Нами впервые показано, что в зависимости от вида опухоли,рецептор экспрессирован либо толькоэндотелиальными клетками(лейомиома, саркома Капоши),либо еще и в опухолевых клетках (опухолипочек и яичников). Вполне возможно, чтоуровень экспрессии рецептора опухолевымиклетками отражает стадиюпрогресса опухоли либо обеспечиваетзащиту клетки от воздействия радио-и химиотерапии.

Результаты проведенныхнами исследований указывают на то, чтодальнейшие исследованиядолжны быть направлены на изучениепотенциальных различий в свойствах данного рецептора в нормальных ираковых тканях с целью разработки методовспецифичной регуляции(ингибирования либо стимуляции) их функции,в зависимости от роли которую они играют втой или иной опухолевой или нормальнойткани, а также для предотвращения побочных эффектов[Nikitenko etal., 2006].Данного рода исследованиядолжны включать изучениефармакологии и фенотипа рецепторовкоторые CL образует в клетках, в которых онэкспрессирован in vivoв норме и при патологии(например, раковых опухолях). Болееподробно данные идеи описаны в нашемнедавнем обзоре [Nikitenko et al., 2006].

Использованиеразработанных реактивов и методов вдиагностике неоплазм и раковыхопухолей

Для обеспечениялечения раковых опухолей необходимысовременные диагностические методы. Ксожалению, методы диагностики рака почек внастоящее время отсутствуют. Полученные внаших исследованиях данные о возможнойроли АМ вбиологии рака почек (Рисунок20), а также разработанные методыисследования экспрессии CL рецептора, позволяютдиагностировать данный вид рака ипрогнозировать исход данного заболевания у индивидуальныхпациентов, поскольку нами было обнаруженакорреляция экспрессии CLрецептора и прогнозом развития болезни упациентов с раком почек [Nikitenko etal., 2007].Кроме того, на основе метода3С разработаны методы диагностики раковых и других заболеваний[Akoulitchev et al., 2006; Ramadass et al,., 2007].

Перспективымодулирования функционированияадреномедуллиновых рецепторов с цельюкоррекции их функции при патологияхразвития и функции сосудистой системы(разработка ингибиторов и активаторов сиспользованием современных методов итехнологий).

Результаты нашихисследований механизмов регулирующихэкспрессию и функцию G-белок связывающего рецептора CL вклетках и тканях человека указывают наналичие и роль многоступенчатого регуляционногопроцесса. Таким образом, регуляция функцииCL рецептора может бытьосуществлена на нескольких уровнях(Рисунок 22) и поэтому использование несколькихсовременных технологий может бытьприменено с данной целью (Таблица 4).

Многоступенчатаярегуляция специфической экспрессии ифункциональных свойств CL рецепторав эндотелиальных клеткахмикроциркуляторного русла человека.

Нами был разработанособенный реактив для специфическогоингибирования АМ
рецептора. Мы использовали методгенетической инженерии дляполучения
моноклональныхантител узнающих CL/RAMPгетеродимер,экспрессированный на
поверхности клетки (Рисунок 23).Оценка антител указывает на то, чтоони
распознают CL/RAMP2 гетеродимер (АМ1рецептор) (данные непоказаны).

Использование данныхантител в функциональных исследованияхпоказало, что они обладаютспособностью ингибировать действие АМ и,соответственно, оказывать влияние нафизиологию эндотелиальныхклеток человека (Рисунок 23). Проведениедальнейших исследованийукажет на возможность использованияданных и других антител (Таблица 4) для ингибирования ангиогенеза враковых опухолях и регуляции АМ сигналовпри патологиях связанных сповышенной активностью данного пептидаили его рецептора АМ1 (CL/RAMP2).

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»