WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 10 |

Роль специфическойтранскрипции CALCRL гена в эндотелиикровеносных сосудов и лимфатическихсосудов человека

Проведенные намиисследования указывают на специфичностьэкспрессии CL в эндотелии сосудов различныхтканей и органов человека (Рисунки 5 и 9).Дальнейшее изучение механизмов регуляцииэкспрессии CALCRL гена в эндотелии человека в нормальных тканях и раковыхопухолях позволит разработать методыконтроля экспрессии данного гена с целью ингибированияпатологического ангиогенеза или регуляциифункции кровеносных илимфатических сосудов.

С целью дальнейшегоизучения регуляции экспрессии CALCRL гена в эндотелии нами была использована модель саркомыКапоши (КС) как эндотелиальной опухоли[Nikitenko andBoshoff, 2006]. Современнымиисследованиями было показано, что КСпроисходит из эндотелиальных клеток,поскольку профиль/спектр экспрессии геновв этой неоплазме очень схожс таковым в лимфатическом эндотелии [Wanget al., 2004]. Этиологически КС связан с инфекцией клетокчеловеческим герпесвирусом 8 (humanherpesvirus 8,HHV8, или Kaposi’s sarcoma herpesvirus, KSHV)[Boshoff et al., 1995].

Нашими исследованиямис применением методов DNA microarray, иммуноблоттинга и иммуногистохимии было показано,что KSHVрегулирует экспрессиюCALCRL гена вЭКМР человека (Рисунок15).

Герпесвирус саркомыКапоши (KSHV) регулирует экспрессию СALCRL (CL) в эндотелиальных клеткахмикроциркуляторного руслачеловека.

Эндотелиальные клеткимикроциркуляторного руслачеловека (ЭК) были инфицированы вирусомсаркомы Капоши (ЭКKSHV). (А) Экспрессиягенов была выявлена методомDNA микрочипа. Относительная экспрессияотражена с использованиеманалитической шкалы (синий цвет – пониженная экспрессия; красный цвет – повышеннаяэкспрессия). Результатыанализа также отображены в виде графика, демонстрирующегоповышенную экспрессиюСALCRL винфицированных клетках ЭКKSHV (Vartet al., 2007). (Б) ЭкспрессияСALCRL также повышена втканях Капози саркомы посравнению с нормальной кожей. (В)Экспрессия CL в тканях Капоши саркомы былаизучена с использованием метода иммуногистохимии иполиклональных антителпротив рецептора. Вторичные антитела меченные пероксидазойхрена и диаминобензидиноваяреакция были использованыдля выявления локализации рецептора в опухолевыхверетенообразных клетках саркомы Капоши(левый и центральныйснимки). Этиологическиданные клетки связаны синфицированиемэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека и ихпоследующей трансформациейв опухолевые клетки. Срезы тканиобработанные преиммунной сывороткойбыли использованы вкачестве контроля (правыйснимок). Участок срезаиспользованный на центральном и правомснимках обозначен на левом снимке. (Г)Эндотелиальные клеткимикроциркуляторного русла человека (ЭК) были инфицированы вирусомКапоши (ЭКKSHV)in vitro. Экспрессия CL была изучена сиспользованием методаиммуноблоттинга. Трансляция рецепторасоответствует повышенной транскрипции вЭК инфицированных вирусом.

Мы произвеликлонирование 27 генов, кодируемых вирусом[Vart etal., 2007] и провели анализ с целью выявленияданных генов на экспрессию CALCRL гена человека (Рисунок 16). Нами быловыявлено что К2 ген (кодирующий вирусныйинтерлейкин 6) является таким кандидатом (Рисунок 16). Такимобразом, онкогенные вирусы способнырегулировать экспрессиюCALCRL гена человека. Поэтому нами былавыдвинута гипотеза о том, что АМ и CALCRL играют роль впатологическом ангиогенезе илимфангиогенезе, являющимся одним из симптомов КС. Дальнейшиеисследования направлены на изучениемеханизмов регуляции данного G-белок связывающего рецептора сцелью использования данных для разработкиметодов диагностики и, возможно, терапииданной неоплазмы.

Современнымиисследованиями с использованием мышиныхмоделей по изучению роли генов в эмбриогенезе была показанароль CALCRLв развитии сосудистойсистемы [Dakor et

al., 2006] и развитии эдемыпри его отсутствии, а также сходстводанного фенотипа с моделямив которых был выключен ген лиганда – адреномедуллина.[Caron etal., 2000; Shindo et al., 2001: Shimosawa et al., 2002]. Данные этих исследований такжеподтверждают предположения о роли CALCRL/CL вразвитии и функционировании сосудистойсистемы и припатологическом лимфангиогенезе иангиогенезе, как например при развитии КС.

Анализ регуляцииэкспрессии СALCRL гена в эндотелиальныхклеткахмикроциркуляторногорусла человека индивидуальнымигенами герпесвирусасаркомы Капоши (KSHV).

Лентивируснаябиблиотека (27 индивидуальных KSHV генов) была произведена с использованиемвектора pSINи векторовдвух векторов необходимыхдля производства лентивирусных частиц. Списокклонированных генов и ихпроизводные.Эндотелиальные клетки были инфицированы с использованием лентивируснойбиблиотеки и экспрессиясоответствующих вирусныхгенов была проверена сиспользованием методаRT-ПЦР. Эффективность инфекции была проверена сиспользованием лентивирусных частицпроизведенных с использованием pSIN вектора экспрессирующего GFP (greenfluorescentprotein). Проведенный количественный RT-ПЦР анализ с использованием метода TaqMan выявил регуляцию CALCRL гена вирусным генов К2, кодирующимцитокин-вирусный интерлейкин-6(vIL-6).

Потенциальная рольмеханизмов сенситизации и десенситизацииадреномедуллиновых рецепторов вэндотелиальных клетках человека вдисфункции эндотелия и присердечно-сосудистых заболеваниях

Транскрипция CALCRL гена (Рисунки 5 и 6)и экспрессия данного G-белок связывающегорецептора на поверхности клетки (Рисунок 8)являются одними из первоначальныхступеней в регуляции экспрессии данногорецептора в эндотелии. Циркуляция данногорецептора и механизмы его сенситизации идесенситизации к стимуляции лигандами также играютзначительную роль в дальнейшей регуляциифункции CL (Рисунки 12, 13 и 14)[Nikitenko etal., 2006; Parameswaran and Speilman, 2007].

Нами былаиспользована модель диабетической беременностидля изучения механизмов десенситизации исенситизации АМ рецепторов в сосудистойсистеме человека. Нами было показано, что сосуды плаценты придиабетической беременности теряютчувствительность (десенситизируются) к стимуляцииадреномедуллином (данные не показаны).Таким образом, повышенноедавление у женщин при патологическойбеременности (диабете в данных исследованиях) может являтьсярезультатом недостаточного контролярасширения сосудов адреномедуллином. При этомрегуляция АМ рецепторов в сосудистойсистеме может привести куменьшению кровеносного давления упациентов и, таким образом, облегчитьтечение беременности придиабете.

Аналогичный феноменнаблюдался при повышении концентрации АМ вкультуре эндотелиальныхклеток [Nikitenko et al., 2006]. Кроме того, измененияв работе адреномедуллиновых рецепторовнаблюдается в in vivoусловиях когда концентрация АМ повышена. Так например, прихронической сердечной недостаточности,сердечно-сосудистомзаболевании,при которомконцентрация АМ в крови значительноповышена, значительный, и в то же времядлительный эффект пептида на артериискелетных мышц значительноослаблен, частично из-за недостаточнойпродукции оксида азота всосудах предплечья [Kato el al., 1996; Nakamura et al., 1997]. В то же время механизмы подобныхэффектов до настоящего времени оставалисьне изученными. Данные проведенныхнами исследований указываютна то, что данные эффекты могут бытьрезультатом интернализацииCL рецептора в эндотелиальных клетках,поскольку invivo в тканях человека рецептор преимущественноэкспрессирован именно в этих клетках (см.Рисунки 5 и 9), а также потому,что АМ стимулирует продукцию оксида азотаэтими клетками [Zhang and Hintze, 2001].

Таким образом,несмотря на повышенный уровень АМ припатологиях, чувствительность адреномедуллиновых рецепторовможет быть понижена при определенныхпатологиях и поэтому существуетнеобходимость коррекции их функции (илиресенситизации) с целью обеспечения нормальной работысосудистой системы.

Рольадреномедуллина иего рецепторнойсистемы впролиферации и дифференцировкестволовых клеток

Современнымиисследованиями было показана роль АМ впролиферации и дифференцировке стволовых клетокчеловека [Iwase et al., 2005; Yurugi-Kobayashi et al., 2006; Murakami et al., 2006]. Авторы предположили, что АМ влияет настволовые клетки через гетеродимер CL/RAMP2, но какие-либо данные в поддержкуданной гипотезы приведены не были.Разработанные нами антитела против CLчеловека могут помочь в дальнейшем решитьпо крайней мере вопрос обэкспрессии функциональной формы данногорецептора в стволовых клетках человека, атакже выявить, действительно ли АМ (или CGRP)взаимодействует с этимG-белок связывающим рецептором вданных клетках.

Нашими исследованиямибыла показана экспрессия всех компонентоврецепторной системы АМ (CL и RAMPs), по крайнеймере на транскрипционном уровне, в предшественниках эндотелиальныхклеток человека (данные не показаны) и вбластоцисте на раннихстадиях эмбрионального развития человека(Рисунок 17). Данные результаты указывают навозможную роль CL в дифференцировкестволовых клеток эмбриона и костного мозга. Таким образом,использование разработанных намиреактивов поможет ускоренному изучению роли АМ вэмбриогенезе и дифференцировке стволовыхклеток человека.

Экспрессия СL и RAMPs встволовых клетках человека.

Экспрессия СL и RAMPs вбластоцисте человека была исследованаметодом ОТ-ПЦР. CL, RAMP1 и RAMP2, но не RAMP3 мРНК экспрессируется вбластоцисте человека нашестом дне развития. мРНК миометрияслужила положительным контролем,поскольку все компоненты рецепторной системыэкспрессированы в данной ткани, включая RAMP3. -актин служилконтролем.

Роль адреномедуллина иего рецепторной системы в ангиогенезе приразвитии раковых опухолей ипатологических заболеваний органоврепродукции

Несмотря наизначальные неудачи и негативныйрезультаты клинических испытаний, значительный прогресс сделан втечение нескольких последних лет виспользовании ингибиторов ангиогенеза вопухолях и неоплазмах/новообразованиях.Несколько клиническихисследований с использованием ингибиторовключевого ангиогенного фактора - VEGF(фактор роста эндотелия) -A, не только подтвердилипредставление о том что ангиогенез – важная мишень для леченияопухолевых процессов, но также выявилифеномен противодействиянекоторых видов опухолей антиангиогеннойтерапии [Hurwitz et al., 2004; Kerbel et al., 2002]. В настоящее времясуществуют свидетельства того чтоключевые ангиогенные факторы могут бытьзамещены другими факторами (в том числе иАМ) [Nikitenko et al., 2006] в процессе развития и дальнейшегопрогресса болезни, или что другие известные или новые ангиогенныемолекулы могут быть ответственны закомпенсирующий («прорывной») ангиогенез вгипоксическом микроокружениираковых опухолей во время анти-ангиогенныхстратегий [Ferrara and Kerbel, 2005]. Кроме того, эффективные тканеспецифические ангиогенныефакторы могут быть ответственны за такоепротиводействие анти-ангиогенной терапии[LeCouter et al., 2002].

Поэтому определеннойтрудностью в транслировании результатов иоткрытий в исследованияхмеханизмов ангиогенеза являетсяопределение различий в молекулярныхмеханизмах ангиогенезамежду индивидуальными видамиопухолей/стадиями путем определения роли известных и новыхфакторов, включая ключевые итканеспецифичные ангиогенные факторы. Данный подходпозволит осуществлять выбор селективнойанти-ангиогенной терапии изспектра тех что уже используются вклинических исследованиях или в процессеразработки, а также определять вероятностьэффективности для индивидуальных пациентов [Ferrara and Kerbel, 2005] для лечения того или иного типаопухоли.

В течение несколькихпоследних лет проявляется повышенныйинтерес к изучению адреномедуллина, которыйобусловлен в значительной мере ролью,которую данный пептид играетв ангиогенезе (Рисунок 18) [Nikitenko et al.,2006].

Роль адреномедуллинав прогрессииопухолей.

Предыдущимиисследованиями была предположена роль гипоксии ицитокинов врегуляции экспрессии и секреции
адреномедуллина (АМ), способствует развитиюксенографтов раковыхклеток путем стимуляцииавтокринного роста и повышенной выживаемости опухо-левых клеток, а также путем паракринного механизма за счет воздействия на окружающие сосуды. Возможные внутриклеточные эффекты действия АМна клетки микроокружения опухоли(гладкомышечные клетки стенки сосудов,эндотелиальные клетки и опухолевые клетки) предполагаетроль данного пептида в начальном развитииопухоли, устойчивости к химиотерапии и прогрессии. АС – аденилатциклаза,GC – гуанилатциклаза,PKA – протеинкиназа А,PKG – протеинкиназа G, PLC – фосфолипаза С,MEK – протеинкиназаактивированная митогеном, ERK – экстрацеллюлярная киназа,регулирующаяся сигналом (также называемаяMAPK –протеинкиназа активированнаямитогеном).

В случае АМ, как новогоангиогенного фактора (Рисунок 18),существует нескольконасущных вопросов представленных ниже[Nikitenko etal., 2006]:

1). Вкаких раковых опухолях наблюдаетсяповышенная экспрессия АМ

2). Какие клеткиэкспрессируют адреномедуллиновыерецепторы в раковых тканях человека

3). Существует ликорреляция экспрессии CL рецептора склинико-патологическими показаниями вопределенных раковых опухолях

Исследованиеэкспрессии адреномедуллина в раковыхтканях человека

На начальном этапе мыисследовали в каких раковых опухоляхнаблюдается повышенная экспрессия адреномедуллина путемиспользования ДНК чипов и клонированныхнами плазмидных векторовдля получения CALCRL зондов. Из 13 изученных опухолейнами была выявленаповышенная экспрессия АМ в раковых тканяхпочек (Рисунок 19).

Поэтому наши дальнейшие исследования поизучению экспрессии CL были направлены наданный вид опухоли, а также на изучениелейомиомы, рака яичников и КС (см. Рисунок15), где предварительныерезультаты указывали на возможную роль АМи его рецепторов в развитии данныхнеоплазм [Hague et al., 2000; Giacolone et al., 2003; Vart et al., 2007].

Экспрессия адреномедуллина

(АМ) в нормальных иопухолевых тканях.

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»