WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 10 |
.++++



поджелудочная







железа

эндотелий

.+/++

бета-клетки экзокринные железистыеклетки

.+/++

ОЯ


плацента

эндотелий

.-





амнион

эндотелий

.-





Таблица 3. Экспрессия CL в тканях иклетках человека.

Полуколичественныйанализ экспрессии CL в индивидуальныхклеточных типах в тканях человека былпроведен по следующейшкале: –•тсутствиеокраски; -/+ очень слабая; + слабая; ++ средняя;+++ сильная.

Экспрессия СL и RAMPs вэндотелиальных клетках человека.

(А) Экспрессия СLпроанализирована с использованием методаиммуноблоттинга. Белковыеэкстракты из эндотелиальных клеток микроциркуляторного руслакожи человека были проинкубированы с эндогликозидазойF (F, ячейка 2), либо эндогликозидазой H (H, ячейка 3) или вих отсутствии (-, ячейка 1) споследующим проведением SDS-PAGE при восстанавливающих условиях ииммуноблоттинга с использованием антител LN-1436 выращенными против СL человека. Стрелка,негликозилированный (~37 кД); открытый ромб,основно-гликозилированный (~45 кД); черный ромб, терминально-гликозилированный (~55кД) виды рецептора. ~55 кД СLвосстанавливается до ~37 кД белка в послеобработки эндогликозидазойF, но устойчивы к действию эндогликозидазы H. Впоследствии мембраны былиобработаны сиспользованием антител против -актина дляподтверждения использования одинаковыхколичеств белковых экстрактов. (Б) Экспрессия СL и RAMPs мРНК в эндотелиальных клеткахмикроциркуляторного руслакожи (ячейка 1), легких (ячейка 2), миометрия (ячейка 3) и эндометрия(ячейка 4) человека были проанализированы с использованиемметода РТ-ПЦР. Праймеры для -актина былииспользованы в качестве контроля дляиспользования одинакового количества РНКдля генерации кДНКиспользованной для РТ-ПЦР. В качествеконтроля была использованаРНК изолированная из ткани почек (ячейка 5). Цифры справапоказывают размеры амплифицированныхПЦР-фрагментов.

Экспрессия рецепторана поверхности эндотелиальных клеток(терминально-гликозилированная форма)коррелирует с экспрессией RAMP2 и RAMP3, но неRAMP1 генов (Рисунок 11Б).

Полученные данныеуказывают нато, что вероятнее всего CL формируетгетеродимер CL/RAMP2 и/или CL/RAMP3на поверхности ЭКМР человека, и поэтомупредставляет собой АМ1 и/или АМ2рецептор.

Локализация CLрецептора в эндотелиальных клетках

Данный эндотелиальныйрецептор экспрессирован на поверхностиклетки и в эндоплазматическом ретикулуме(данные не показаны) in vitro,что подтверждает данныеиммуноблоттинга (Рисунок 11),поскольку наличиеосновно-гликозилированного рецептораобычно ассоциировано с еголокализацией в эндоплазматическомретикулуме, а теминально-гликозилированного – на поверхностиклетки, т.е. в плазматической мембране,после дополнительногогликозилирования в результатевзаимодействия с RAMP в эндоплазматическомретикулуме [McLatchie et al., 1998].

Специфичность иинтернализация CL рецептора вэндотелиальных клетках

Для проверкипредположения о том, что эндотелиальный CLобразует АМ рецепторы (либоАМ1 - CL/RAMP2 и/или АМ2 - CL/RAMP3)нами были проведеныисследования по выявлениюфенотипа рецепторов, экспрессированных вэндотелиальных клетках человека.

Прежде всего нами былоисследовано какие рецепторы - AM или CGRP– экспресированны эндогенно наповерхности ЭКМР человека. Результатыпроведенных исследований сиспользованием методов по определениюаккумуляции cAMP, являющейся однойиз сигнальных молекул в системеадреномедуллиновых рецепторов, и миграцииэндотелиальных клетокпоказали, что как AM так и CGRP рецепторы экспрессированы в этихклетках (данные непоказаны). Эти данные противоречатсделанному предварительно предположению, что эндотелиальныйCL образует только АМ рецепторы.

Поэтому нами былипроведены эксперименты по исследованиюдинамики интернализацииэндотелиального CL в ответ на стимуляциюAM или CGRP. Прежде всеготакое решение былообусловлено тем, что данные работ Kuwasako и коллег [2001] указывают на то, что CL/RAMP1,CL/RAMP2 иCL/RAMP3 гетеродимеры интернализуются поразному в ответ настимуляцию AM или CGRP. Например, CL/RAMP1 (CGRP1рецептор) интернализуетсяпреимущественно при взаимодействии сCGRP, а CL/RAMP2(АМ1) и CL/RAMP3(АМ2) рецепторы – при взаимодействии с АМ.

Проведенные намиисследования показывают, что CL вэндотелиальных клетках интернализуется только привзаимодействии с АМ (Рисунок 12; данные дляCGRP не показаны). Эти данные соответствуютданных об экспрессии RAMP2 и RAMP3, но не RAMP1, в ЭКМР, предполагающих экспрессиюАМ1 и АМ2 рецепторов (Рисунок 11).

Для проверки данныхвыводов и выяснения, существует ликакое-либо взаимодействие между CGRP иэндотелиальным CL, нами были проведеныэксперименты с использованием антагонистов AM и CGRP рецепторов(AM22-52 иCGRP8-37соответвенно). Данные антагонисты взаимодействуют срецепторами, но не вызывают каких-либофункциональных изменений[Poyner et al., 2001].

Интереснымрезультатом проведенных экспериментовявилось выявление того, что как AM22-52так и CGRP8-37способны ингибироватьинтернализацию эндотелиального CL послестимуляции АМ (Рисунок 12).Данные результаты указывают на то, чтоCGRP также может

взаимодействовать сэндотелиальным CL. Если это так, тонаблюдаемое ранее влияние не только АМ, но также и CGRP на миграцию и аккумуляцию cAMP вЭКМР человека (данные не показаны) могутбыть связаны со взаимодействиемданного пептида с CL рецептором.

Рисунок 12





Взаимодействие AM и CGRP сСL экспрессированным вэндотелиальных клеткахчеловека.

Внутриклеточноераспределе-ние СL в ЭКМРчеловека до (Control) и после стимуляции лигандом (AM 100 nM; в течение 15 минут) с или без добавленияантагонистов

AM22-52 и CGRP8-37 (1М),

было определено сиспользованиемиммунофлу-оресценции.Клетки были зафиксированысразу после стимуляции. Иммунофлуо-ресцентная окраскабыла проведена с использованием антител против CLчеловека и вторичных антител меченных ФИТЦ (зеленый цвет).DAPI использовался для окраски ядер(синий цвет).Представленные рисунки отображают результаты двухэкспериментов и демонстрируют экспрессиюрецептора на клеточной поверхности(зеленые стрелки) и после интернализации(короткие стрелки).

Десенситизация CLрецептора в эндотелиальных клетках

Для проверки данногопредположения нами были проведеныэксперименты по исследованию механизмовдесенситизации эндотелиального CL. Намибыло выдвинуто предположение, что если CLвзаимодействует как с АМ, так и с CGRP, тостимуляция/интернализация рецептора привзаимодействии с одним лигандом должнапривести к потере ответа наповторную стимуляцию не только к лигандукоторый был использован дляпервичной стимуляции, но и на стимуляциюдругим лигандом. Результаты проведенных нами экспериментовприведены на Рисунке 13, и показывают, чтопри стимуляции АМ ответ(фосфорилирование Akt) на стимуляцию сCGRP потерян, и наоборот.

Десенситизацияэндогенных AM и CGRP рецепторов в эндотелиальных клетках.

Динамика десенситизации

эндогенных AM иCGRP
рецепторов вэндотелиальных
клеткахмикроциркуляторного
русла (ЭКМР) человека была
изучена путем определения

степенифосфорилирования Akt
(Akt-P).В контрольной группе
клетки былипростимулированы
100 nM АМ(линии 2-4) либо
CGRP (линии 11-13)в течение
обозначенноговремени. В
группе предварительнойстимуляции (с АМ либо CGRP; +/–обозначает было ли проведено предварительноестимулирование), клетки былипростимулированы с АМ (5-9) либо CGRP (14-18) в течение 15 минут, азатем –проинкубированы в среде без лиганда втечение 30 минут. В группе предварительной стимуляции клетки затем былизаново простимулированы либо с тем жеантагонистом (100 nM) (5-8 для АМ и 14-17 дляCGRP соответственно) или другимантагонистом (100 nM) (CGRPдля клеток преинкубированных с АМ, линия 9, и АМдля клеток, престимулированных с CGRP) дляизучения десенситизациирецепторов. Клетки стимулированные VEGF (10 ng/ml втечение 10 мин.; линия 10) служили в качестве контроля.

Таким образом,результаты проведенных нами исследованийпредполагают следующую модель регуляции рецептора,экспрессированного в ЭКМР человека(Рисунок 14). ЭндотелиальныйCL может взаимодействовать как с АМ, так и сCGRP (Рисунок 14). Данное взаимодействие слюбым из лигандов приводит кдесенситизации рецептора. Однако потеряфункции (десенситизация)рецептора только в случае взаимодействия сАМ обусловлена интернализацией данногоG-белок-связывающего рецептора.

Полученные данныеоткрывают интересное направление визучении биологии АМ и CGRP рецепторов вклетках и тканях человека. Особенно важнымявляется изучение биологииCL при патологических условиях, при которыхуровень АМ или CGRP повышен в тканях и клетках человека, какнапример сердечно-сосудистые заболеванияразличной этиологии [Hinsonet al., 2000]. В данных условиях избыточнаяэкспрессия одного или другого лиганда может привести к полнейшейдесенситизации эндотелиального CL к обоимлигандам. Принимая во вниманиезначительную роль обоих пептидов вбиологии сосудистойсистемы и эндотелиальных клеток вчастности [Hinson et al., 2000; Nikitenko et al., 2002;Brain and Grant et al., 2004], данные изменения могуткардинально повлиять на состояние органов и тканей припатологии, особенно в том случае если CLдействительно являетсяпосредником всех изученных до данногомомента эффектов АМ на эндотелиальнуюклетку [Hinson et al., 2000; Nikitenko et al., 2006]. Результаты проведенных намиисследований указывают нато, что экспрессия и функциональноесостояние CL могут оказывать значительноесостояние на функционированиеэндотелиальной клетки и играть роль вразвитии дисфункции эндотелия приразличных патологиях.

Свойства эндотелиального СLи

ассоциированной с нимрецепторной системы для AM и CGRP.

Эндотелиальный СLэкспрессирован на клеточной поверхности в качестве терминальногликозилированного рецептора(полисахаридные остаткисвязанные с аминотерминусом схематическипредставлены как структурысерого цвета). AM и CGRP стимулируютфосфорилирование Akt (Akt-P).(IIА) Рецептор интернализуется инаправлен на деградациюпосле стимуляции АМ, но (IIВ) остается наклеточной поверхности послевзаимодействия с CGRP.Взаимодействие либо с АМ (I-IIА- III) или CGRP(I-IIВ) приводит к десенситизации (IV)рецептора к обоим пептидам, независимо оттого какой агонист был использован дляначальной стимуляции, ипотере активности за счет различных механизмов.

Рольадреномедуллиновых рецепторов в тканяхчеловека в норме и при некоторых патологиях.

Проведенные исследованияпоказали,что АМиграет важную роль в развитии и функции сосудистойсистемы животных. В то же время, несмотря наполученные нами данные ороли пептида и механизмов регулирующих егоэкспрессию и функцию его рецепторов в ЭКМР человека in vitro, вопрос о значении АМ и его рецепторовв организме человека внорме и при различны патологиях остаетсянедостаточно изученным. Этообусловлено прежде всего отсутствиемдостаточного количества данных обэкспрессии АМ и функциональных эндогенныхадреномедуллиновых рецепторов в органахи тканях человека.

Поэтому нами былпроведен спектр исследований сприменением разработанных нами методовдля изучения экспрессии CALCRLгена человека ифункциональной формы рецептора, а такжемеханизмов регулирующих его функцию вэндотелиальных клетках человека.Наши исследованиявключали исследованиевозможности практическогоприменения полученныхзнаний офункционированиирецепторной системы адреномедуллина в эндотелиальныхклетках при патологических заболеванияхсосудистой системы, в томчисле:

1). Исследование роли АМи его рецепторной системы в ангиогенезепри развитии раковыхопухолей и патологических заболеванийорганов репродукции путемисследования экспрессии егорецепторов.

2). Исследованиевозможности использования разработанныхреактивов и методов
(антител против человеческого CLрецептора и методовопределениясубхромосомной
организации CALCRLгена) для диагностикинеоплазм, раковых опухолейи других
заболеваний (в том числеисследование корреляции экспрессиии клинико-патологическихпоказателей).

3). Исследование возможности модулирования функционирования

адреномедуллиновыхрецепторов с целью коррекции их функциипри патологиях развития и функциисосудистой системы (к вопросу о разработкеингибиторов и активаторов сиспользованием современных методов итехнологий, включая разработку антител противрецептора, экспрессированного наповерхности клетки).

Практическоеприменение исследований функционированиярецепторной системы адреномедуллина вэндотелиальных клетках при патологическихзаболеваниях сосудистой системы

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»