WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |
VEGFR II (KDR)

Barleon et al., 1994

Gift from Dr H.Weich

a CD31 –cluster designation 31; CD68 – clusterdesignation 68; VEGFR II – vascular endothelial growth factorreceptor II.

Маркеры CD31, фактор вон Виллебранда и местасвязывания лектина Ulex europeusagglutinin присутствовали на эндотелии как втканях так и invitro в течение 4-5 пассажей (Таблица 2).Интенсивная типичная“точечная” окраска на фактор вонВиллебранда была отмечена в цитоплазме эндотелиямикроциркуляторного русла эндометрия идецидуальной ткани в культуре (Рисунок 2). При достиженииконфлюенции антиген CD31 присутствует вместах клеточных контактов вданных клетках (Рисунок 2). Кроме того,клетки обладали способностью кэффективной пролиферации как показано сприменением маркера Ki-67 (Рисунок 2).

Кроме того, нами былииспользованы антитела противгладкомышечного актина, кератинов и CD68 (Таблица 1) дляопределения присутствия мышечных иэпителиальных клеток, атакже макрофагов соответственно вкультурах эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла. Данныеэксперименты выявили наличие всего 1-5%неэндотелиальных клеток в менее чем 5процентах полученных препаратов первичныхклеток из исследуемых тканей.

Таким образом,оптимизация метода привелак получению чистых (95-100%) первичных культурЭКМР из тканейчеловека (децидуа иэндометрий- рисунок 2).

Применение данногометода с использованием ткани миометриятакже привело к успешному получению ЭКМРиз данной ткани человека. ПроисхождениеЭКМР миометрия было охарактеризовано сиспользованием морфологических,иммуногистохимических имолекулярно-биологических методов.

Исследование ролиадреномедуллина

Получение чистыхкультур ЭКМР позволило впервые изучитьвлияние АМ на биологию данного типа клеток человека ипроверить гипотезу о роли этого пептида вангиогенезе в тканях иорганах человека. Нами были проведеныэксперименты по изучению роли АМ в росте, миграции и регуляции монослоя ЭКМР(Рисунок 3).

Митогенные свойстваадреномедуллина

Митогенный анализ(влияние на пролиферацию) свойствадреномедуллина был проведен с использованием методаинкорпорации радиоактивно меченноготимидина (метил-3Н) [Nikitenko et al., 2000]. Первичные эндотелиальные клеткичетвертого пассажа были посажены в 96-луночные тарелки (5000 клеток налунку). На следующий день среда былазаменена на среду с низкимсодержанием человеческой сыворотки (20%). Натретий день клетки были простимулированы факторами роста:эндотелия (VEGF), фибробластов (bFGF), эпидермиса (EGF) илиадреномедуллином (AM) всреде содержащей 10% сыворотки человека и сдобавлением радиоактивномеченного тимидина (1 Ci). После 24-часловойинкубации

клетки былитрипсинизированы и собраны на фильтры дляизмерения радиоактивности с помощьюсцинтилляционного бета-счетчика.

АМ индуцировалинкорпорацию тимидина в культурах ЭКМР эндометрия имиометрия (Рисунок 3) человека.Интенсивность стимуляции была сравнима стаковой полученной при использованииизвестных ангиогенныхфакторов –VEGF и bFGF,экспрессия которых быларанее выявлена в маткечеловека [Bicknell and Rees, 1995].

Адреномедуллинстимулирует миграцию эндотелиальныхклеток

Для исследованиявлияния АМ намиграцию эндотелиальных клеток намибыли использованы аппаратыTranswell (Рисунок 3) [Nikitenko et al., 2006]. Эндотелиальные клетки были посажены в верхнююкамеру вкладки Transwell. Пептиды(адреномедуллин, CGRP или амилин,принадлежащие к одному и тому же семействупептидов) [Poyner et al., 2002]были добавлены в нижнююкамеру. Полная среда для культивированияэндотелиальных клеток(содержащая несколько факторов роста дляэндотелиальных клеток) или VEGF были использованы вкачестве положительных контролей. Средабез факторов роста (0.5% ТС) была использована в качествеотрицательного контроля. После 24-часовойинкубайии клетки былипомечены флуоресцентным красителем (calcein-AM),и количество мигрировавшихклеток определено путем измеренияфлуоресценции клеток с использованиемсчетчика Elx800 с возможностями чтениянижней части вкладыша. Данные былипроанализированы и

статистическиобработаны, и фотографии получены сиспользованием Программ RC4v30 PowerReports и NiconCoolPix 990 Camera соответственно. Толькомигрировавшие сквозь порысветонепроницаемой мембраны клетки могутбыть детектированы счетчиком.

Проведенныеэксперименты показали что АМ и CGRP, но неамилин, являются факторамимиграции эндотелиальных клеток (Рисунок 3).Полученный при использовании данных пептидовмиграционный эффект был сравним поинтенсивности с таковымполученным при использовании ангиогенногофактора VEGF. Значительный интерес при этом представляетсходство ангиогенных эффектов(пролиферации и миграции) полученных при использованииэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека иin vivo моделей сиспользованием тканей цыпленка (Рисунок 3)и ксенотрансплантированныхклеточных линий сверхэкспрессирующихАМ в мышиных моделях (Рисунок 3).

+++

+++

++

++

++ или-

НО

Антиген

Криостатныесрезы Парафиновыесрезы Культура 4-гопассажа

Фактор вон

+++

Виллебранда


CD31

+++

Виментин

++

Места связывающие

НО

лектин UEA1


Ki-67

НО

VEGFR II (KDR)

++

Гладкомышечный

-

актин


Кератины

-

5,6,8,17,18,19


CD68

-

+++

+++

++

+++

+ или- НО

--

- -

- -
Таблица 2.

Иммунореактивностьэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла эндометрия человека накриостатных и парафиновыхсрезах и в культуре с использованиеммоноклональных и поликлональных антител (включаярезультаты по окраске с использованиемлектина UEA-1).

Интенсивность окраскибыла определена полуколичественнымметодом - +++ очень интенсивная окраска; ++сильная окраска; + слабаяокраска; - отсутствие окраски; NE – анализ непроведен. а– Сходнаяокраска была получена при использованииполиклональных и моноклональных антителна замороженных срезах.

Сокращения указаны вТаблице 1.

a Данная таблица такжевключает результаты окраски с использованием лектина Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA1).

b Сходная окраска была получена напарафиновых икриостатных срезах.

Окраска была оценена сиспользованием полуколичественногометода: +++ - очень сильная окраска, ++ -

сильная окраска, + -слабая окраска, - - отсутствие окраски, НО– не определено.

Роль адреномедуллина вбиологии
эндотелиальных клеток

микроциркуляторногорусла (ЭКМР) человека.

(А) Пролиферация ЭКМРэндометрия в
ответ настимуляциюАМ(результаты
стимуляции сиспользованием VEGF,
bFGFи FGF приведены длясравнения).
(Б) ПролиферацияЭКМР миометрия
пристимуляции АМ. (В) Миграция
ЭКМР кожи (см. ниже) в ответна
стимуляцию АМ. Данныйэффект АМ
на ЭКМР in vitro сравним с эффектом
наблюдаемым in vivoпри использовании
(Г) CAM (chicken chorioallantoic
membrane assay) (фото адаптировано из
Zhao et al., 1998) и (Д) мышиных
ксенографтных моделей(фото
адаптировано изOehler et al., 2001) (Е)
АМ защищаетмонослой ЭКМР от
действияактиваторов апоптоза
(например, низкоесодержание
сыворотки всреде для культивации).
Данный эффект противоположен(Ж)
эффекту, наблюдаемому всосудистой
системе мышей при

выключении/удалении гена

адреномедуллина (фотоадаптировано из Shindo et al., 2001).

Ингибированиеапоптоза адреномедуллином

Нами были такжепроведены исследования по выявлению ролиАМ в ингибировании апоптоза,вызванного пониженной концентрациейсыворотки в культивируемой среде (Рисунок 3). Результаты данныхисследований показывают, что АМ защищаетмонослой эндотелиальных клеток человекаот разрушенийвызванных пониженной концентрацией сыворотки и гибельюэндотелиальных клеток в данных условиях.Значительный интерес при этом представляет сходствоморфологии эндотелия человека приингибировании АМ сигналов иэндотелия органов у гомозиготных АМ -/-эмбрионов мышей (Рисунок 3) [Shindoet al., 2001].

Таким образом, врезультате первого этапа исследованийнами были разработаны методы изолированияэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла эндометрия имиометрия,как органов в которых происходят процессыфизиологического ангиогенеза. Данныеметоды получения эндотелиясосудов микроциркуляторного руслачеловека позволили впервые проверитьгипотезу о возможной роли адреномедуллинав данных клетках при процессах ангиогенезаи изучить роль этого пептида в биологииданного типа клеток. Результатыпроведенных экспериментовпродемонстрировали впервые рольадреномедуллина в росте и миграцииэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека.

Необходимо отметить,что одновременно исследованиями, проведенными влабораториях зарубежом, былисделаны открытия о роли АМ в эмбриогенезе[Caron andSmithies, 2001;Shindo et al., 2001] и развитии раковых опухолей [Oehleret al., 2001; Oehler et al., 2002],ингибировании апоптоза[Kato etal., 1998; Shichiri et al., 1999] и гиперпроницаемости эндотелиальных клеток [Hippenstiel et al.,2001]. Обобщение данных исследований и предыдущего знания о вазоактивныхсвойствах АМ позволило нам сделатьзаключение о важной ролиданного пептида в микроциркуляторном русле[Nikitenko etal., 2002].

В свою очередь данныеоткрытия указывали на необходимостьисследования адреномедуллиновых рецепторов вклетках и тканях человека, и в том числемеханизмов регулирующих ихэкспрессию и функцию.

Механизмы, регулирующиеэкспрессию адреномедуллиновыхрецепторов

Необходимостьизучения экспрессии эндогенныхадреномедуллиновых рецепторов обусловлена прежде всего тем чтолиганд может быть секретированпрактически любой клеткой.Однако остается неясным, какие клеткиявляются мишенью для данного пептидногогормона в органах и тканях.Прежде всего,данная информация необходима дляразработки методов терапиии регуляции (активирования илиингибирования) физиологических и патологических процессовангиогенеза. Поэтому нами был разработанспектр методов для изученияэкспрессии, а также механизмоврегулирующих транскрипцию гена ифункционирование рецептора вэндотелиальных клетках.

Исследованиями, проведенными С.Фордом и коллегами [McLatchie et al., 1998] было показано, чтоG-белок связывающий рецептор Calcitonin receptor-like receptor (CRLR, впоследствии переименованный вCALCRL ген и CLрецептор в соответствии с номенклатурой Геномного ПроектаЧеловека иФармакологического Союза, соответственно) путемформирования гетеродимера с одним из трехRAMPs (белков модифицирующих активность рецепторов) образуетрецепторы для нескольких пептидовкальцитониновой группы.Таким образом, CL играет ключевую роль вформировании адреномедуллиновых рецепторов(Рисунок 4). Поэтому наши исследования наследующем этапе былисфокусированы на исследовании механизмовтранскрипции CALCRL гена и экспрессии функционального CLрецептора.

Исследованияэкспрессии CALCRL гена in vitro и in vivo

Первоначальноисследованиями, проведенными сиспользованием тканей человека в нашей лаборатории и применениемметода гибридизации in situбыло показано, что мРНКCALCRL локализована преимущественно вкровеносных сосудах in vivo.(Рисунок 5). Данные этих исследований указали на то,что in vivo именно микрососуды являются мишенью дляадреномедуллина и CGRP, несмотря на широкий эффект данныхгормонов invitro на многие другиеклеточные линии происходящие из разныхорганов [Hinson et al., 2000]. Несмотря на данные результаты,исследованию регуляции экспрессииадреномедуллиновых и CGRP рецепторов препятствовалоотсутствие знаний прежде всего о регуляцииэкспрессии CALCRL гена. Поэтому первоначальной цельюнаших исследований являлось клонирование промотера, выявлениерегуляторных элементов в его структуре иисследование механизмов регулирующихтранскрипцию CALCRLгена в эндотелиальныхклетках человека.

Транскрипционныйанализ CALCRL гена с использованием методаRT-PCR

Для транскрипционногоанализа (профайлинга) экспрессиичеловеческого CALCRL гена, нами были использован методполимеразной цепной реакции спредварительным использованием обратнойтранскриптазы (RT-PCR) икДНК полученных из эндотелиальных инеэндотелиальных клеток, а также из тканейчеловека. Полученные данные показали, чтоэкспрессия CALCRL гена происходитпреимущественно в микроциркуляторныхэндотелиальных клетках человекаизолированных из легких, эндометрия,миометрия и кожной ткани (Рисунок 5).

Определениетранскрипционного старта CALCRL гена сиспользованием метода RАСЕ

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»