WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |

Апробациядиссертационной работы.Результаты исследованийдоложены на конференциях: Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany, 1999;XIth International Congress of Histochemistry andCytochemistry, York, United Kingdom, 2000; AnnualICRF Colloquium, Warwick, United Kingdom, 2000; Introduction to Molecular andCellular Research, San-Diego, USA, 2000; 8th IFPAMeeting, Melbourne, Australia, 2002; “Angiogenesis: basic mechanisms and therapeutic implications”, Ascona,Switzerland, 2002; 5th Imperial College School of Medicine Symposium“Vascular endothelium: Role in disease pathogenesis and as a therapeutic target”, London, United Kingdom, 2002; 676thBiochemical Society Meeting, Edinburgh, United Kingdom, 2002; 6thInternational Engelhardt Conference on Molecular Biology, Mосква и Санкт-Петербург, РоссийскаяФедерация, 2003; Special FEBS 2003 Meeting on Signal Transduction,Brussels, Belgium, 2003; The 40th American Association for Cancer ResearchAnnual Meeting, New Orleans, USA, 2003; JointInternational Symposium on CGRP, Amylin and Calcitonin 4th Symposium on Adrenomedullin and Proadrenomedullin N-20 Peptide,Zurich, Switzerland, 2004; XXXIV Congress of NordicFederation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland, 2004; XI European Placenta GroupMeeting, Glasgow, United Kingdom, 2005; XIth Biennial International Gynecologiccancer Society Meeting, Santa Monica, USA, 2006; The24th European Conferenceon Microcirculation. From Vascular Biology to Clinical Microcirculation, Amsterdam, Netherlands, 2006; The 9th International Workshop onKaposi’s Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, CapeCod, USA, 2006; The Physiological Society 2006 MainMeeting, London, United Kingdom; The 21st Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (ISH2006), Fukuoka,Japan, 2006.

Публикации: основные материалыработы изложены в одной монографии, руководстве по эмбриологии, двухглавах книг, 13 статьях в международных журналах, 21 материалах международных научных конференций, двух оформленных патентах наизобретение.

Структура и объемдиссертации. Диссертация изложена на 198страницах машинописного текста и содержит следующиеразделы: введение, обзор литературы,описание материалов и методовисследования, результаты и их обсуждение,общие выводы и указатель цитируемой литературы (325 источников). Работаиллюстрирована 65 рисунками и 12таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ

Объекты и методыисследования

Для реализациипоставленных задач были использованыследующие методы исследования:

  • клеточно-биологические(выделение и описание первичных культурэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека,исследование ангиогенной активности пептидов с применениеммоделей ангиогенеза invitro);
  • гистологические(иммуногистохимия, иммунофлюоресценция, микрочипы тканей, гибридизация in situ; световая, флуоресцентная иконфокальная микроскопия);
  • молекулярно-биологические (Northernблоттинг, Western блоттинг, методполуколичественной и количественнойполимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНКмикрочипы, 3’-и 5’-RACE, методопределения субхромосомной структурыгенов, клонирование);
  • биотехнологические ибиохимические (получение, очистка ихарактеризация поликлональных и моноклональныхантител, дегликозилирование, ELISA);
  • вирусологические(получение препаратов вируса саркомыКапоши, конструкция и использованиелентивирусной «библиотеки», кодирующейиндивидуальные гены данного онкогенного вируса).

РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Задачей первого этапаисследований являлось определениевозможной роли АМ в ангиогенезе в тканях человека. Дляпрактического выполнения поставленной задачи былонеобходимо получение эндотелиальныхклеток микроциркуляторногорусла (ЭКМР) органов и тканей, в которыхпроисходят процессы физиологического илипатологического ангиогенеза. Нами быливыбраны эндометрий и миометрий человека для разработкиметодов получения ЭКМР и изучения ролиадреномедуллина, посколькуфизиологический ангиогенез характерен длятканей матки и предварительные данныеэкспериментов проведенных в нашейлаборатории указывали на возможную роль данного пептида вэтих тканях [Hague et al., 2000]. Необходимостьполучения ЭКМР из органов вкоторых происходит ангиогенез дляизучения роли новых ангиогенных факторов обусловленотем, что именно пролиферация и миграцияэндотелия микроциркуляторного русла, а неосновных сосудов, необходимы длявозникновения новых сосудовпри ангиогенезе в тканях. Кроме того,эндотелий микроциркуляторного русларазных органов гетерогенен,т.е. может отличаться по своимфункциональным свойствам, морфологии и экспрессиирецепторов, а потому и различнойспособностью отвечать на стимуляцию даннымифакторами.

Разработкаметодовизолирования,характеризациии культивирования эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека.

Для получения ЭКМР намибыли использованы лектин Ulex Europeus Agglutinin 1 (UEA1),связанный с магнитнымишариками (Рисунок 2). UEA1селективно распознаетэндотелиальные клеткинепосредственно в тканях (Рисунок 2), путемсвязывания с фукозой на поверхности этих клеток.

Получение ихарактеристика эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) изэндометрия человека.

Эндотелиальные клеткибыли получены из
эндометриальной ткани матки (А)после гистерэктомии.
(А)Радиограмма среза матки (спиральныеартерии
эндометриянаполнены суспензией сульфата барияи
желатина).Эндотелиальные клеткимикроциркуляторного
руслаэкспрессируют фукозу, распознаваемуюлектином
UlexEuropeus Agglutinin-1 (UEA-1) выявленого путем (Б)
использования методаиммунофлуоресценции (ФИТЦ –
зеленый цвет;белые стрелки; DAPI -окраска ядер).
Магнитные шарики покрытые лектиномUEA-1 были
использованыдля получения чистых культур ЭКМР,
формирующих (В) характерныймонослой в культуре
(магнитные шарики в первом пассажееще прикреплены к
поверхности клеток; красные стрелки) и (Г)капиллярную
сеть наматриксе Матригель.Иммунофлуоресцентная
характеризация ЭКМР матки сиспользованием антител
против специфических маркеров (Д)фактора вон
Виллебранда(vWF) и (Е) CD31. ЭКМР активно растут в культуре, чтопродемонстрировано иммунофлуоресцентной окраской наприсутствие (Ж) маркера пролиферирующихклеток Ki67.

Первоначально ткани эндометрия были собраны в средуМакКоя (McCoy’s5A medium), содержащую 10% телячьей сыворотки(ТС) и антибиотики, и сохранены на 12-16 часовпри 40С. Наследующий день ткань была разрезана скальпелем на кусочкиразмерами 1 мм2, которые впоследствии были инкубированы в течении 2 часов всреду МакКоя содержащей 2 мг/мл коллагеназыи 10% телячьей сыворотки при постоянномразмешивании. Данная процедура приводит краспаду тканевых структур и получениюклеточной суспензии, которая затемфильтруется через стерильное сито с порамиразмером 100 мкм для удалениянерастворенных тканей. Затем клеточнаясуспензия центрифугируется и промываетсянесколько раз средой. Обобщенная схема получения и оценки ЭКМР человекапоказана на Рисунке 2.

После этогопервоначально клеточная суспензия можетбыть обогащена на содержание ЭКМР может путемцентрифугирования полученной клеточнойсуспензии в “непродолжительном” градиенте“Percoll”. При этомклеточная масса ресуспендируется в 20% растворе “Percoll” в физрастворе ссодержанием бычьего сывороточногоальбумина (БСА) и помещаетсяна поверхность двух слоев раствора “Percoll” –40%-ного и 60%-ного. После этоготрехслойный “непродолжительный”градиент (20%-40%-60%) “Percoll” центрифугируетсяпри 670 g втечении 30 минут и обогащеннаяэндотелиальными клетками популяцияформируется между слоями 40%-ного и 60%-ногорастворов “Percoll”. Клетки собираются спомощью Пастеровской пипетки иресуспендируются в среде МакКоясодержащей 10% ТС.

Магнитные шарикиготовятся предварительно, за день допроведения изолированияэндотелиальных клеток. Лектин Ulex europeus agglutinin был связан ковалентно к тозилактивированным магнитнымшарикам “Dynabeads” M-450 в соответствии спредварительно опубликованными работами[Jackson et al., 1990]. Одинаковые объемы лектина (0.2мг/мл в боратном буфере, рН 9.6) и шариков(2х107шариков/мл) и проинкубированы в течение 12-16часов при 40С ипостоянном перемешивании. На следующий день шарики были промытытри раза в физиологическом растворе припомощи магнитногоконцентратора и ресуспендированы вфизиологическом растворе с содержаниемБСА до концентрации2х107шариков/мл, после чего сохранены при40С доиспользования.

Селекцияэндотелиальных клеток была проведена припомощи магнитных шариков покрытых лектином Ulex europeus agglutinin путем инкубирования при 40С в течении 10 минут ипостоянном перемешивании.Клетки были инкубированы с шариками впропорции 1:3 в общем объеме 0.5 мл. Послеэтого прикрепленные клетки были собраныпри помощи концентраторамагнитных частиц, с удалениемсупернатанта,не содержащего магнитных шариков, но содержащего клеткидругих типов (не-эндотелиальные). Даннаяпроцедура проводится три раза, спромежуточной промывкой частиц в средеМакКоя содержащей 1% телячьей сыворотки в течение 1минуты.

Очищенные популяцииЭКМР эндометрия, полученные изиндивидуальных препаратов (количествоклеток варьировало от 5000 до 17000) были посажены в чашки Петри(35мм2; приплотности клеток 6000 на ячейку) предварительно покрытые коллагеномIV типа (5g/см2).Культуры клеток были инкубированы при 370С в инкубаторе вовлажной атмосфере с содержанием 5%СО2. Средаменялась через каждые 48часов. При достижении конфлюенции клеткибыли пересажены путемиспользования раствора содержащеготрипсин и ЭДТА, с последующим разведением всреде для культивирования впропорции 1:2.

Полученные даннымметодом клетки первоначально содержатмагнитные шарики прикрепленные к их поверхности (Рисунок 2).Клетки образуют специфические колонии,характерные для данного типаклеток, в течение первых 24 часов. Изпроведенного количества экспериментов 80%имели свои результатом успешноеизолирование эндотелиальных клеток. Лишьчасть из полученных препаратов (<5%)содержала другие типыклеток, количество которых, тем не менее, непревышало 1-5%. ЭКМР эндометрия имели морфологиютипичную для клеток данного типа (Рисунок 2)с большим ядром, заметным контактнымингибированием в точках соприкосновения и отсутствиемнаползания клеток друг на друга придостижении конфлюенции.Магнитные шарики оставалисьприкрепленными к эндотелиальным клеткампосле того как они былипосеяны впервые, впоследствии былоотмечено их спонтанное освобождение при первой пересадке.Кроме того, эндотелиальные клетки обладалиспособностью образовывать“капилляроподобные” структуры припересадке на специфический матриксМатригель (Рисунок 2). Предыдущимиисследованиями было показано, что толькоэндотелиальные клетки обладают такойспособностью. Более подробные детали проведениявышеуказанных экспериментов описаны внаших работах [Nikitenko et al., 2000;Nikitenko et al., 2006].

Полученные из тканейпервичные клетки необходимо былоохарактеризовать на наличие специфических маркеров того илииного типа клеток. ЭКМР былиохарактеризованы с использованием специфическихмаркеров эндотелия (Рисунок 2, Таблицы 1 и 2).Для проведения анализаспецифичности полученнойпопуляции эндотелиальных клеток нами был проведениммуногистохимический анализ клетокизолированных из эндометрия, миометрия и децидуальнойткани. Дляэтого нами был использован спектрмоноклональных иполиклональных антител, распознающихантигены, которые экспрессированы специфически на определенных типахклеток (Таблица 1). Иммуногистохимия ииммунофлюоресценция былипроведены соответственно методамописанных в спектре нашихработ [Nikitenko et al., 2000; Nikitenko et al., 2001; Nikitenko et al., 2006].

Таблица 1.

Моноклональные иполиклональные антитела использованнныедля характеризации эндотелиальных

клетокмикроциркуляторного русла.

Антитело/Клон

Антигенa

Литература

Источник

1А4

Гладкомышечный актин

Skalli et.al., 1986

Dako

F8/86

Фактор вонВиллебранла

Naiem et.al., 1982

Dako

JC/70A

CD31

Parums et.al., 1990

Dako

LP34

Кератины 5,6 and 18

Moll et al., 1982

Dako

MNF 116

Кератины 5,6,8,17,19


Dako

PG-M1

CD68

Falini et al., 1993

Dako

V9

Виментин

Osborn et al., 1984

Dako

MM1

Ki-67


Novocastra

Поликлональные

Фактор вонВиллебранла

Bukh et al., 1986

Dako

Поликлональные

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»