WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

На правах рукописи

Никитенко ЛеонидЛеонидович

Роль адреномедуллина иего рецепторов

в функционированииэндотелиальной клетки человека

( в норме и при некоторыхпатологиях)

14.00.16 - патологическаяфизиология,

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученойстепени

доктора биологическихнаук

ИРКУТСК–2007

Работа выполнена в ГУ"Научный центр медицинской экологии"Восточно-Сибирского научного центра Сибирскогоотделения РАМН, Оксфордском Университете(г.Оксфорд, Великобритания) иЛондонском Университете (г.Лондон,Великобритания)

Научныйконсультант Академик РАМН, доктормедицинских наук, профессор

Колесников СергейИванович

Официальныеоппоненты доктор биологических наук,профессор

Гутник ИгорьНэрисович

доктор медицинских наук, профессор

Семинский ИгорьЖанович

доктор биологическихнаук

Попкова СофияМарковна

Ведущаяорганизация ГОУ ВПО«Московская медицинская академия

им. И.М.Сеченова»

Защита состоится 26октября 2007 г. в 14 часов на заседанииДиссертационного Совета Д.001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центрСибирского Отделения Российской академии медицинскихнаук» по адресу: 664003, г Иркутск, ул. Тимирязева,16.

С диссертацией можноознакомиться в библиотеке ГУ«Восточно-Сибирский научный центрСибирского Отделения Российской академии медицинскихнаук»

Автореферат разослан« » 2007г.

Ученый секретарь диссертационногоСовета,

доктор медицинскихнаук ШолоховЛ.Ф.

Актуальностьпроблемы.

В настоящее времяисследованию процессов развития ифункционирования кровеносной и лимфатической сосудистых систем внорме и при патологии уделяется большоевнимание.Эндотелиальные клеткимикроциркуляторного русла (ЭКМР) играют ключевую роль в развитии ифункции кровеносных и лимфатическихсосудов. Избыточная пролиферация итрансформация, либо нарушение функции ЭКМРприводит к патологическомуангиогенезу/ лимфангиогенезу или дисфункциисосудистой системы – являющимсяпоказателями злокачественных опухолей имногих других заболеваний [Carmeliet, 2003 и2005].

Существенный прогрессбыл достигнут за несколько последних лет висследовании молекулярныхмеханизмов развития и функционированиясосудистой системы, и в выявлении ключевых ангиогенных илимфангиогенных факторов, а также виспользовании данных знанийдля ингибирования ангиогенеза илимфангиогенеза при опухолевых процессахи неоплазмах/новообразованиях различнойэтиологии, а также для терапии сердечно-сосудистых заболеваний уэкспериментальных животных [Alitaloet al., 2005; Ferrara andKerbel, 2005].

Одной из современныхзадач в “транслировании” (применении впрактике для терапии человека) данных открытий в областиисследования механизмов ангиогенеза илимфангиогенеза на животных являетсяпроверка роли известных и новых факторов вбиологии эндотелиальных клеток человека ивыявление механизмов регулирующихэкспрессию и функцию их рецепторов, а такжеопределение их потенциальной роли в патогенезе опухолевых исердечно-сосудистых заболеваний [Nikitenkoet al., 2006].

В связи с этимразработка методов получения икультивирования эндотелиальных клетоккровеносного илимфатического микроциркуляторного руслачеловека, а также исследование роли новых ангиогенных илимфангиогенных факторов в биологииданного типа клеток представляет собой актуальнуюзадачу в области биомедицины.

Несмотря на то, чтоэксперименты, проведенные на животных,указывали на роль нового ангиогенногофактора адреномедуллина (АМ) при развитиисосудистой системы у животных вэмбриогенезе и при опухолевых процессах,существовал ощутимый недостаток подобногорода исследований сиспользованием клеток человека. Крометого, информация о распределении и функционированииэндогенных адреномедуллиновых рецепторовэкспрессированных в клеткахи тканях человека также оставаласьнеизученной до настоящего времени. В связи с этимнеизвестными оставались как роль АМ и егорецепторов в тканях человека, так ивозможности их использования для леченияраковых и других заболеваний [Nikitenkoet al., 2006]. Данная проблема существует и длядругих ангиогенных факторов. Так, несмотря на несомненную роль однойиз ключевых ангиогенных молекул - факторароста эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF) вразвитии раковых опухолей в экспериментальных исследованиях наживотных, применение ингибиторов данногоангиогенного фактора невсегда приводит к положительнымрезультатам [Ferrara and Kerbel, 2005].

Трудности в даннойобласти обусловлены отсутствиемсистемного подхода в анализе экспрессии и функции факторовангиогенеза и их рецепторов in vitro иin vivo вклетках и тканях человека.Под системным подходом подразумеваетсяпроведение исследований не только роли данных факторов наэндотелиальные клетки человека, но иисследование транскрипции итрансляции генов кодирующих данныерецепторы в органах и клетках, изучение механизмов регулирующихэкспрессию рецептора на поверхностиклетки,

специфичности еговзаимодействия с потенциальными лигандами(фармакология рецептора), атакже механизмов десенситизации иресенситизации.

Данный подходпозволяет рассматривать не толькомеханизм действия определенного ангиогенного фактора намолекулярном и клеточном уровнях, но ипотенциал использованияданных знаний в теоретической биологии атакже при разработке методов диагностики, интервенции и терапийдля прогнозирования эффективностиприменения ингибиторов иактиваторов данных механизмов, выявлениятипов раковых опухолей (а также индивидуальных пациентов), вкоторых действие данных препаратов можетбыть наиболее результативным, ипотенциального использования в клиникедля лечения широкого спектра сердечно-сосудистых, раковых,инфекционных и других заболеванийсвязанных с патологическим(лимф)ангиогенезом или дисфункциисосудистой системы

Исходя из этого, целью данного исследования являлось оценкароли пептидаадреномедуллина (АМ) в биологииэндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла человека имеханизмов регулирующихэкспрессию и функцию его рецепторов внорме и при некоторых патологиях на основекомплексногоморфо-функционального имолекулярно-генетическогоисследования.

Изучение ролиадреномедуллина и его рецепторной системыпутем комплексно-систематическогоподхода.

В соответствии с цельюисследования были поставлены следующиезадачи:

  1. Разработать методыполучения и культивированияэндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) изтех тканей человека, в которых происходятпроцессы физиологическогоангиогенеза;
  2. исследовать рольАМ впервичных культурах ЭКМР человека;
  3. исследоватьэкспрессию адреномедуллинового рецептора- рецептора подобного кальцитониновомурецептору (calcitonin receptor-like receptor, CL, кодируемого CALCRL геном) в клетках и тканяхчеловека;
  4. исследоватьмеханизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека вЭКМР в норме и при патологии путемклонирования и описания промотера,изучения субхромосомнойорганизации данного гена и влиянияонкогенных вирусов (на примере вируса саркомы Капоши) на еготранскрипцию;
  5. произвести иохарактеризовать антитела против CLрецептора;
  6. исследоватьспецифичность к различными лигандам, атакже механизмы сенситизации и десенситизации, CL рецептора вэндотелии человека;
  7. исследовать рольадреномедуллина и его рецепторов вангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологическихзаболеваний органов репродукции, путемизучения экспрессии пептидаи локализации функциональной формы CLрецептора в тканях человека в норме и припатологии (в опухолях почек и яичников итканях саркомы Капоши).
  8. исследоватьвозможность использования разработанныхреактивов и методов для диагностики неоплазм, раковыхопухолей и других заболеваний;
  9. исследоватьвозможность модулированияфункционирования адреномедуллиновыхрецепторов с целью коррекцииих функции при патологиях развития ифункции сосудистой системы.

Основные положениявыносимые на защиту.

  • АМ является новымангиогенным фактором в тканях человека засчет своей способностиактивировать пролиферацию и миграцию, атакже ингибировать апоптоз эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла.
  • Экспрессия CALCRL гена человеказависит прежде всего от клеточно- иткане-специфического фона. При этомключевым фактором в транскрипции CALCRL гена является его трехмернаясубхромосомная структура, в то время какактивность промотера играетвторичную роль.
  • Десенситизация CLрецептора в эндотелиальных клеткахчеловека при избыточной экспрессии лиганда отражается наего функции и может играть роль приразвитии сердечно-сосудистых заболеваний различнойэтиологии.
  • Разработанныереактивы и методы могут применяться длядиагностики и коррекции патологий связанных с функциейадреномедуллиновых рецепторов, напримерпатологического ангиогенеза игиперпроницаемости эндотелия.
  • Разработана иприменена концепция системного анализамеханизмов комплексной многоуровнево-селективнойрегуляции экспрессии и функцииадреномедуллиновых рецепторов, а также их роли вполноценном функционированииэндотелиальной клетки в норме и при патологии.

Научная новизнаработы.

Разработаны иусовершенствованы методы получения икультивирования эндотелиальных клетокмикроциркуляторного русла (ЭКМР )человека.

Впервые продемонстрирована роль пептидаАМ в биологииЭКМР иангиогенезе в тканяхчеловека.

Впервые описанымеханизмы регулирующие экспрессию CALCRL гена человека ифункцию CL рецептора в тканяхи эндотелии человека. Впервыепродемонстрирована роль CLрецептора как рецептора для АМ и пептидаотносящегося к гену кальцитонина (CGRP) вЭКМР человека, а также выявлены механизмыего десенситизации.

Впервые разработанметод определениятрехмерной субхромосомной структурыгенов. Сконструированыплазмидные векторы, позволяющиеэффективно оценивать экспрессию CALCRL гена человека, активность егопромотера и осуществлять экспрессию CLрецептора в клетках млекопитающих. Впервыеклонированы новые, ранеенеохарактеризованные транскрипты CALCRL гена человека и лентивирусная«библиотека», включающая 27 генов, кодирующих различные вирусныебелки вируса саркомы Капоши.

Впервые полученыуникальные реактивы - поликлональныеантитела против человеческого CL рецептораи блокирующие моноклональные антителапротив гетеродимера CL/RAMP,экспрессированого на поверхности клетки.Показана специфичность данных антител ивозможность оценки функциональногостатуса CL рецептора, а такжерегуляции его функции в клетках и тканяхчеловека.

Впервыепродемонстрирована экспрессия CL рецепторав клетках и тканях человека в норме и при патологиях (на примереопухолевых тканей почек, яичников,лейомиомы и саркомыКапоши).

Разработана иприменена концепция системного анализамеханизмов комплексной многоуровнево-селективнойрегуляции экспрессии и функцииадреномедуллиновых рецепторов, а также их роли вполноценном функционированииэндотелиальной клетки в норме и при патологии.

Практическаязначимость исследования.

Разработанные реактивыи методы могут быть использованы длядальнейших исследований биологииэндотелиальных и стволовых клетокчеловека, экспрессии и функции CL рецептора в нормальных иопухолевых клетках и тканях человека, атакже для диагностикираковых, сердечно-сосудистых и другихзаболеваний.

Полученные плазмидныевекторы могут быть использованы в областибиотехнологии, а полученныеполиклональные антитела против CLрецептора человека - как для научно-исследовательских работ, так и дляприменения в области диагностики ипрактической медицины.

Разработанныемоноклональные антитела противгетеродимеров CL/RAMP могут

являтьсяэффективным методомкоррекции патологий,связанных с функцией

адреномедуллиновыхрецепторов, как напримерпатологическийангиогенеза и
гиперпроницаемостьэндотелия.

Изученная роль АМ в биологии ЭКМРчеловека и полученные данные о механизмах регулирующих,экспрессию и функцию адреномедуллиновыхрецепторов, представляютсобой большой интерес при поискеэффективных методов противоопухолевой терапии исердечно-сосудистых заболеваний связанныхс ангиогенезом и функциейэндотелия в тканях человека.

Полученные результатырасширяют понимание комплексной регуляцииадреномедуллиновыхрецепторов и позволяют оценитьвозможность применения ингибиторов/активаторов действияАМ длятрансляционных исследований и терапии заболеваний, связанных сизбыточной или недостаточной экспрессиейсамого пептида, либо его рецепторов, атакже проводить предварительныеисследования по воздействиюразличных веществ на экспрессию, транспорти функцию CL в эндотелиальных клетках, как источнике еголокализации invivo в тканях человека.

Полученные данныесвидетельствуют о необходимости продолженияисследований фармакологииадреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиальныхклетках опухолей так и в самих опухолевыхклетках, а также выявленияразличий рецептора, экспрессированного в нормальном иопухолевом эндотелии.

На основеразработанных технологий полученияполиклональных и моноклональных антител против CL рецепторачеловека, определения трехмернойсубхромосомной структуры генов и векторных плазмид,содержащих промотер CALCRL гена человека, разработаны методы их использования длядиагностики раковых и других заболеваний,а также оформлено и получено два патента наизобретение.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»