WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Анализируя ооциты амфибий, нам удалось впервые зарегистрировать непосредственное слияние пористых пластинок с наружной ядерной мембраной (рис. 2, в, г). Слияние мембран пористых пластинок с ядерной оболочкой происходит локально, в участках, не содержащих ядерных или цитоплазматических пор, и в месте слияния формируется, вероятно, новый участок ядерной оболочки. Поскольку предположение о возможной функции пористых пластинок в качестве запаса структурных компонентов для ядерных пор уже высказывалось ранее в литературе (Cordes et al., 1995; Burke, Ellenberg, 2002; Harel et al., 2003), и было установлено, что в процессе роста ооцита ксенопуса, одновременно с ростом ядерной оболочки и формированием ядерных пор, уменьшается количество цитоплазматических пор (Cordes et al., 1995), наши данные могут свидетельствовать о непосредственном использовании пористых пластинок для формирования новых фрагментов ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов.

Рис. 2. Электронно-микроскопические фотографии пористых пластинок в ооцитах амфибий. а, б – стопки упорядоченно расположенных пористых пластинок с пороподобными комплексами в цитоплазме ооцитов (стрелками отмечены пороподобные комплексы; на вставке представлен пороподобный комплекс на большем увеличении); в, г – слияние пористых пластинок с ядерной оболочкой (длинные стрелки указывают на место слияния) пп – пористые пластинки; я – ядро.

На основании наших исследований можно предположить два варианта использования пороподобных комплексов: они могут разбираться на отдельные нуклеопорины, которые переходят в перинуклеарное пространство и используются для формирования ядерных поровых комплексов во вновь сформированнных фрагментах ядерной оболочки, либо, поскольку пороподобные комплексы симметричны, они могут разделяться на две равные части, каждая из которых содержит центральный и цитоплазматический отдел будущей ядерной поры. Достройка внутриядерного отдела происходит позднее. Первый вариант может иметь место при делении ядер в растущих эмбрионах дрозофилы, для которых была продемонстрирована способность нуклеопоринов в пороподобных комплексах переходить из растворимого состояния, в составе цитоплазматического пула белков, в структурные комплексы (Onischenko et al., 2004). Второй вариант больше подходит для таких активно растущих клеток как ооциты, а также для опухолевых клеток, которым в короткие сроки требуется сформировать большое количество новых ядерных пор.

Динамика ядерной оболочки в процессе развития ооцитов.

На рисунке 3 представлен фрагмент ядерной оболочки ооцита ксенопуса. Можно различить составные компоненты ядерной оболочки: наружную и внутреннюю ядерные мембраны и ядерные поровые комплексы. Ядерные поровые комплексы легко определить по характерной баскет-структуре их внутриядерного отдела (рис. 3, а, б). На поперечном срезе со стороны цитоплазмы видны составные компоненты ядерного порового комплекса: гранулы цитоплазматического кольца, радиально расположенные спицы и центральный транспортер (рис. 3, в).

Рис. 3. Вид ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий. а, б – фрагменты ядерной оболочки целых ооцитов на поперечном срезе (ням – наружная ядерная мембрана; вям – внутренняя ядерная мембрана; пунктиром отмечены баскет-структуры ядерных поровых комплексов); в – фрагмент ядерной оболочки на продольном срезе (вид со стороны цитоплазмы; одинарными стрелками отмечены цитоплазматические гранулы ядерной поры; двойными стрелками – спицы центрального отдела поры; тройной стрелкой – центральный транспортер

Исследование морфологии ядерной оболочки растущих ооцитов амфибий показало, что плотность распределения пор в ней меняется в процессе оогенеза. На ранних стадиях встречаются протяженные участки ядерной оболочки без ядерных пор, в то время как в зрелых ооцитах поры расположены регулярно и с высокой плотностью. Сравнительный морфометрический анализ плотности распределения ядерных пор на единицу

длины ядерной оболочки в зрелых (стадии V-VI) и растущих ооцитах (стадии II-III) показал, что в первом случае ядерные поры расположены в среднем в 3 раза плотнее по сравнению с растущим ядром. Эти данные, а также увеличение размера ядра в ходе оогенеза, свидетельствуют об активной достройке ядерной оболочки и сборке новых ядерных пор в ранних ооцитах амфибий.

Наши исследования показали, что на III стадии оогенеза вблизи ядерной оболочки появляются многочисленные пузырьки ЭПР диаметром от 150 до 300 нм, многие из которых контактируют и сливаются с наружной ядерной мембраной. Мы предположили, что эти пузырьки могут быть вовлечены в сборку ядерной оболочки, поскольку подобный процесс наблюдался ранее при формировании ядерной оболочки в митотически делящихся ядрах. Поэтому была поставлена задача исследовать динамику ЭПР на разных стадиях оогенеза.

Динамика эндоплазматического ретикулума в процессе развития ооцитов.

Морфометрический анализ динамики ЭПР на разных стадиях оогенеза показал, что наиболее заметное увеличение общей площади поверхности мембран ЭПР происходит на III-IV стадиях оогенеза (рис. 4, а). Мы полагаем, что это может быть обусловлено, наряду с другими процессами, такими как вителлогенез, перераспределение ионов кальция, и запасание белков и липидов, необходимых для обеспечения развития будущего эмбриона, участием мембран ЭПР в сборке ядерной оболочки. Для более детального анализа реорганизации ЭПР был проведен сравнительный анализ относительной площади поверхности мембран ЭПР и его относительного объема в разных участках цитоплазмы (рис. 4, б). Совокупность морфометрических и электронно-микроскопических данных показала, что элементы ЭПР, включающие пузырьки и цистерны гладкого и шероховатого ретикулума, распределены неравномерно между различными областями цитоплазмы ооцита, и их локализация в клетке меняется в процессе оогенеза (рис. 4, б, в). На I-II стадиях оогенеза наибольший относительный объем цистерн и пузырьков ЭПР наблюдаются в периферической области цитоплазмы, в то время как остальные области цитоплазмы обеднены этими мембранами. На III-IV стадиях развития происходит перемещение мембран ЭПР с периферии в среднюю и околоядерную области. На последующих стадиях оогенеза ЭПР более менее равномерно распределен по цитоплазме ооцита. Таким образом, наши исследования показали, что на III-IV стадиях оогенеза происходит перемещение компонентов ЭПР в околоядерную область цитоплазмы, где они, вероятно, используются для формирования новых фрагментов ядерной оболочки.

Рис. 4. Динамика эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий. а – изменение общей площади поверхности мембран ЭПР в ооците на разных стадиях оогенеза; б – изменение относительного объема цистерн и пузырьков ЭПР в оогенезе в различных областях цитоплазмы; в – схема, демонстрирующая распределение мембран ЭПР в цитоплазме ооцитов на I-VI стадиях развития (1 – периферическая область; 2 – средняя область; 3 – околоядерная область; я – ядро).

Новый механизм сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках. Электронно-микроскопические исследования показали, что на III стадии оогенеза вблизи наружной мембраны ядра наблюдаются многочисленные пузырьки ЭПР, которые часто сливаются с ней (рис. 5, а, б). Следует отметить, что в области слияния пузырьков ЭПР с ядерной мембраной обнаруживаются участки ядерной оболочки, свободные от ядерных пор, и содержащие незрелые поровые комплексы.

Наши исследования также выявили присутствие мембранных пузырьков внутри ядра, вблизи внутренней ядерной мембраны (рис. 5, в). Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемые структуры возникают в результате перетекания части мембраны пузырька, слившегося с наружной ядерной мембраной, внутрь ядра через мембранный компонент ядерной поры.

Рис. 5. Контакт пузырьков ЭПР с ядерной оболочкой ооцита. а – массовое слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и фрагменты ядерной оболочки без ядерных пор вблизи участков слияния; б – пузырьки ЭПР, сливающиеся с наружной мембраной изолированного ядра ооцита; в, г ­– гладкие мембранные пузырьки вблизи внутренней мембраны ядра. Белые стрелки указывают на мембранные пузырьки, черные стрелки – на ядерные поры.

Основываясь на этих данных, мы предложили модель формирования новых участков ядерной оболочки (рис. 6). Согласно этой модели, новые фрагменты ядерной оболочки образуются за счет слияния пузырьков ЭПР с наружной мембраной ядра и перетекания части пузырька внутрь ядра через мембранный компонент ядерной поры. Далее оба фрагмента уплощаются, приближаются друг к другу, и в них начинается формирование новых ядерных поровых комплексов. Подобные внутриядерные пузырьки были нами выявлены и при анализе срезов интерфазных ядер синцитиальных эмбрионов дрозофилы (предоставлены Губановой Н.В.), на основании чего мы предполагаем, что в растущих интерфазных ядрах соматических клеток сборка ядерной оболочки может идти по аналогичному механизму.

Рис. 6. Модель последовательных стадий формирования ядерной оболочки с участием пузырьков ЭПР. 1 – пузырек ЭПР вблизи ядерной оболочки; 2 – слияние пузырька ЭПР с наружной мембраной ядра; 3 – перемещение части мембраны пузырька внутрь ядра через мембранный компонент ядерной поры; 4, 5 – формирование двухслойной мембраны; 5 – сборка ядерных поровых комплексов в новом фрагменте ядерной оболочки.

Как было показано в опытах in vitro, сборка ядерных поровых комплексов идет через промежуточные структуры (Kiseleva et al., 2001). Мы выявили сходные последовательные стадии формирования ядерных пор in vivo в ядерной оболочке целых ооцитов (рис. 7): сначала новый фрагмент ядерной оболочки состоит из двух мембран и не содержит пор. Затем наружная и внутренняя мембраны изгибаются по направлению друг к другу, сближаются и сливаются. В участках слияния начинается формирование компонентов ядерных поровых комплексов, причем сначала формируется центральный, а затем периферические отделы поры.

Рис. 7. Последовательные этапы сборки ядерных поровых комплексов в растущей ядерной оболочке ооцитов ксенопуса. а – стадии формирования ядерного порового комплекса через промежуточные структуры, выявленные с использованием просвечивающей электронной микроскопии; б – схематическое изображение последовательных стадий сборки ядерных поровых комплексов. Стрелка указывает направление процесса формирования ядерного порового комплекса.

Такая последовательность сборки ядерных поровых комплексов подтвердилась в наших дальнейших исследованиях. При инъекции в ооцит антител к нуклеопорину р62, входящему в состав центрального компонента порового комплекса, наблюдались протяженные участки ядерной оболочки, не содержащие ядерных пор. Морфометрический анализ также показал, что плотность пор в ядерной оболочке после инъекции р62 в ранние ооциты существенно снижается по сравнению с ядерной оболочкой нативных ооцитов. Можно предположить, что недостаток этого белка блокирует процесс сборки ядерного порового комплекса на стадии формирования его центрального отдела и препятствует дальнейшему встраиванию нуклеопоринов в собирающуюся пору. Полученные данные показали, что нуклеопорин р62 необходим на начальном этапе формирования ядерной поры, когда происходит контакт и слияние двух мембран и собирается центральный компонент поры.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что ядерная оболочка в растущих ядрах ооцитов амфибий формируется с участием мембранных компонентов ЭПР и пористых пластинок (рис. 8), а пороподобные комплексы пористых пластинок могут служить источником нуклеопоринов для собирающихся ядерных поровых комплексов.

Рис. 8. Модели сборки новых фрагментов ядерной оболочки в ооцитах амфибий с участием цитоплазматических органелл. а – сборка ядерной оболочки с участием мембран ЭПР; б – ­ сборка ядерной оболочки с участием пористых пластинок.

Механизм сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках отличается от процесса сборки ядерной оболочки в митозе. В митозе оболочка собирается из сливающихся пузырьков ЭПР, затем в ней собираются поры и ламина. В растущих неделящихся клетках, содержащих уже сформированную ядерную оболочку, зрелые ядерные поровые комплексы и ламину, для достройки ядерной оболочки необходимо слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной, перетекание части их мембраны через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра, деполимеризация ламины, формирование нового фрагмента ядерной оболочки, сборка в нем ядерных поровых комплексов, и, затем, сборка ламины.

Внутриядерный актин и его взаимосвязь с ядерной оболочкой.

Используя электронно-микроскопические методы, мы выяснили, какие структуры принимают участие в формировании ядерной оболочки растущих неделящихся ядер со стороны цитоплазмы, однако, оставалось неясным, какие внутриядерные компоненты участвуют в этом процессе. Недавние исследования на уровне сканирующей электронной микроскопии выявили в изолированных ядрах ооцитов ксенопуса актин-содержащие филаменты, контактирующие с баскет-структурами ядерных пор (Kiseleva et al., 2004).

С использованием флуоресцентной микроскопии мы показали, что ядра ооцитов ксенопуса интенсивно окрашиваются конъюгированным с FITC фаллоидином, специфически связывающимся с филаментным актином, что свидетельствует о присутствии в ядрах значительного количества актина. Актин равномерно заполняет всю нуклеоплазму, окружая многочисленные внутриядерные включения сферической формы (рис. 9, а, б). Размер этих включений и их многочисленность позволяют предполагать, что они относятся к ядрышкам, присутствующим в ооцитах в большом количестве.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»