WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

морозова ксения николаевна

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СБОРКИ ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКИ И ЯДЕРНЫХ ПОРОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В РАСТУЩИХ ООЦИТАХ АМФИБИЙ

Гистология, цитология, клеточная биология – 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Новосибирск, 2006

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Киселева Елена Владимировна,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна,

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук

Семешин Валерий Федорович,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Кольцово, Новосибирская область

Защита диссертации состоится « » ноября 2006 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев

Актуальность проблемы. Отличительной особенностью эукариот является наличие ядра и ядерной оболочки, обеспечивающей отделение генетического аппарата клетки. Ядерная оболочка является не просто структурным барьером, но и важной функциональной органеллой, дефекты организации которой приводят к серьезным заболеваниям человека (Worman, Courvalin, 2000; Somech et al., 2005). Поэтому исследование структуры, функции ядерной оболочки и ее динамики в ходе клеточного развития является одной из актуальных задач современной биологии.

Расположенные в ядерной оболочке ядерные поровые комплексы выполняют ключевую роль в обеспечении активного и пассивного транспорта различных молекул между ядром и цитоплазмой (Smythe et al., 2000; Adam, 2001; Fahrenkrog, Aebi, 2003). Процессы сборки-разборки ядерной оболочки и ядерных пор в делящихся клетках достаточно хорошо исследованы в условиях in vitro и in vivo в митозе (Zatsepina et al., 1977; Marshal, Wilson, 1997; Goldberg et al., 1997; Burke, Ellenberg, 2002). Однако вопрос о том, каким образом формируются новые участки ядерной оболочки с ядерными порами на стадии интерфазы, когда в ней уже присутствуют зрелые поры и ламина, практически не исследован. Выяснение механизмов этого процесса требует детального анализа структурной организации, функции и динамики ядерной оболочки и ее составных компонентов с использованием комплекса различных методов. Одной из наиболее удобных моделей для исследования этого вопроса являются ооциты амфибий. Ядро развивающегося ооцита существенно увеличивается в размере, не претерпевая деления, соответственно, растет и ядерная оболочка. Эта особенность, в сочетании с крупными размерами клетки, определяет преимущество ооцита как подходящего объекта для изучения механизмов формирования ядерной оболочки.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы исследовать механизмы сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий и определить возможное участие внутриклеточных структур в этом процессе.

Для осуществления заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить ультраструктурную организацию ооцитов амфибий на разных стадиях их развития.

2. Провести морфологический и морфометрический анализ динамики мембран эндоплазматического ретикулума в растущем ооците.

3. Оценить возможное участие пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, в процессе формирования ядерной оболочки.

4. Проанализировать ультраструктурную динамику ядерной оболочки и ядерных пор в процессе роста ядра ооцита, в частности, определить, изменяется ли плотность распределения пор в ядерной оболочке на разных стадиях оогенеза.

5. Исследовать влияние инъекции антител к нуклеопорину р62, входящему в состав центрального отдела ядерного порового комплекса, на формирование ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий.

6. Сравнить механизм сборки ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий и в митотически делящихся клетках синцитиальных эмбрионов дрозофилы на стадии интерфазы. На основании полученных данных создать модель формирования ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

7. Определить локализацию внутриядерного актина и его взаимодействие с ядерной оболочкой.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе проведен сравнительных анализ ультраструктурной организации растущих ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза. Установлено, что в процессе развития ооцита наблюдается перераспределение внутриклеточных органелл по цитоплазме клетки и меняется равномерность распределения пор в ядерной оболочке.

Впервые в цитоплазме ранних ооцитов обнаружены компактные миелиноподобные структуры, способные разворачиваться в мембраны гладкого эндоплазматического ретикулума. На III-IV стадиях оогенеза зарегистрировано множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и появление фрагментов ядерной оболочки, не имеющих пор, вблизи мест слияния. Гладкие мембранные пузырьки также обнаружены вблизи внутренней ядерной мембраны таких ооцитов, что позволяет предположить возможность перемещения части мембраны пузырька через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра и, во многом, доказывает участие ЭПР в сборке наружной и внутренней ядерных мембран. Впервые в ооцитах амфибий зарегистрировано слияние пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, с наружной ядерной мембраной, что доказывает причастность этих органелл к формированию новых участков ядерной оболочки в этих клетках. На уровне электронной микроскопии установлено, что сборка ядерных поровых комплексов в растущем ядре ооцита ксенопуса происходит через формирование промежуточных структур, и выявлены последовательные этапы этого процесса. Сочетание методов флуоресцентной и электронной микроскопии позволило выявить внутри ядра ооцитов актин-содержащие филаменты, которые могут быть вовлечены во внутриядерный транспорт и, возможно, в сборку ядерной оболочки. Комплексный подход позволил продемонстрировать, что формирование ядерной оболочки – это сложный процесс, в который вовлечены многие внутриклеточные структуры. Результаты проведенного исследования демонстрируют новые аспекты происходящих в ооците процессов, предшествующих оплодотворению, которые могут быть использованы в работах по изучению организации созревающих и оплодотворенных яйцеклеток, а также эмбриональных клеток.

Материалы диссертационной работы, опубликованные в обзорной статье (Морозова и др., 2005), используются при чтении лекций на Кафедре генетики и селекции в Санкт-Петербургском государственном университете и могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов других университетов.

Апробация работы. Результаты, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на отчетной сессии Института цитологии и генетики (2005 г.), а ткаже на российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI МНСК (Новосибирск, 2003); 3-я Международная научная конференция «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Астана, Казахстан, 2003); 7-я Пущинская школа-конференция «Биология – наука XXI века» (Россия, Пущино, 2003); Международный Симпозиум по проблемам Мейоза (Санкт-Петербург, 2003); Российско-Китайский Симпозиум «Наука о жизни» (Пущино, 2004); 8-я Азиатско-Тихоокеанская Конференция по Электронной Микроскопии (Канадзава, Япония, 2004); III съезд ВОГиС (Москва, 2004); Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, Беларусь, 2004); 7-й Межнациональный Микроскопический Конгресс (Портороз, Словения, 2005); Конференция Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Структура и динамика клеточного ядра» (Гран-Мотте, Франция, 2005); XV Всероссийское Совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005); Школа-Семинар Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Молекулярный Транспорт. Каналы и Транспортеры» (Эриче, Сицилия, Италия, 2005) и «Клеточные мембраны: организация и динамика» (Бильбао, Испания, 2006); 16-й Международный Микроскопический Конгресс (Саппоро, Япония, 2006).

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 12 тезисов в сборниках конференций и симпозиумов, 2 статьи приняты в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 149 страницах печатного текста, содержит одну таблицу и иллюстрирована 55 рисунками. В списке литературы приведено 270 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследования. В качестве объекта исследования использовали ооциты шпорцевых лягушек Xenopus laevis и травяных лягушек Rana temporaria. Ооциты на разных стадиях оогенеза идентифицировали по размерам и пигментированности, согласно классификации Дьюри (Duryee, 1950).

Микроинъекции в ооциты осуществляли при помощи микроинъектора (Drummond, Англия) стерильными стеклянными капиллярами. Первичные антитела для инъекции разводили в соотношении 1:50 в растворе фосфатного буфера (PBS, Sigma). Инъецированные ооциты инкубировали 3 часа в растворе Рингера. Для микроинъекций использовали моноклональные мышиные антитела к нуклеопорину р62 (Amersham, Англия) и к ламину В3 (предоставлены доктором Krohne, Германия).

Флуоресцентная микроскопия. Ооциты фиксировали в растворе PBS, содержащем 4 %-ный параформальдегид и 0.1 %-ный Triton-X100; окрашивали флуоресцентно меченым фаллоидином, отмывали в PBS и переносили на предметное стекло в 50 %-ный раствор глицерина в PBS (Guild et al., 1997; Gard, 1999). Анализ FITC-флуоресценции осуществляли на микроскопах Axioskop-2 Plus и LSM 510 (Zeiss, ФРГ).

Электронно-микроскопический анализ. Ооциты фиксировали 2.5 %-ным раствором глутарового альдегида в 0.1 М Хепес-буфере, дофиксировали в 1 %-ном растворе тетроксида осмия, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне, после чего заключали в эпоксидную смолу Агар-100 и полимеризовали в течение 2-х суток при 60 °С (Уикли, 1975). Ультратонкие срезы толщиной 50-70 нм получали с помощью алмазного ножа на ультратоме Ultracut (Австрия), контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца и исследовали в электронном микроскопе LEO 910 (Zeiss, Германия).

Для визуализации внутриядерных актиновых филаментов в просвечивающем электронном микроскопе использовали метод фиксации ооцитов по Парфенову (Parfenov et al., 1995).

Инкубация ооцитов с латрункулином. Для деполимеризации актиновых филаментов ооциты инкубировали с латрункулином (Calbiochem, США) в концентрации 1 g/ml; 3 g/ml; 5 g/ml в растворе Рингера в течение ночи при +4 С. В качестве контроля использовался раствор диметилсульфоксида в растворе Рингера. Затем образцы отмывали раствором Рингера и фиксировали по стандартному протоколу для электронно-микроскопического анализа.

Морфометрический анализ проводился в электронном микроскопе на срезах с использованием статистической программы AnalySIS (версия 2.11, Soft Imaging System).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Особенности ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза. Сравнительный электронно-микроскопический анализ ооцитов показал, что в процессе оогенеза их структурная организация существенно усложняется, что сопровождается перераспределением органелл по цитоплазме клетки. В ооцитах на I-III стадиях развития нами впервые обнаружены компактные миелиноподобные структуры (МПС), состоящие из концентрически упакованных мембранных слоев (рис. 1, а, б). На III стадии мы наблюдали разворачивание компактных МПС в двухслойные мембраны, напоминающие мембраны гладкого ЭПР (рис. 1, в). МПС выявлялись также в фолликулярных клетках и в межклеточном пространстве между ооцитом и фолликулярными клетками, и часто контактировали с плазматической мембраной ооцита. При этом в участках цитоплазмы ооцита, прилежащих к районам контактов с МПС, обнаруживались многочисленные мембраны ЭПР. На основании этого было высказано предположение, что МПС могут представлять запас мембранных компонентов для ЭПР, необходимых на этой стадии активного роста ооцита.

Рис. 1. Компактные миелиноподобные структуры (МПС), разворачивающиеся в двухслойные мембраны, напоминающие мембраны гладкого ЭПР. а – компактная МПС в цитоплазме раннего ооцита (стадия II оогенеза); б – фрагмент разворачивающейся МПС (стадия III оогенеза); в – декомпактизованная МПС кольцевой формы в цитоплазме ооцита на III стадии оогенеза.

Характерной чертой ооцитов амфибий, так же как опухолевых и эмбриональных клеток, является наличие в цитоплазме пористых пластинок – специфического компонента ЭПР, содержащего цитоплазматические поры. Наши исследования показали, что пористые пластинки присутствуют в цитоплазме ооцита на всех стадиях оогенеза в большом количестве и могут содержать от 1 до 20 и более мембран в стопке (рис. 2, а, б). Пористые пластинки состоят из гладких мембран ЭПР, пронизанных многочисленными пороподобными комплексами. При сравнении морфологии пороподобных и ядерных поровых комплексов мы установили, что периферические отделы пороподобных комплексов симметричны и состоят из двух компонентов, сходных с цитоплазматическим отделом ядерных пор (рис. 2, б). Типичная для ядерных пор баскет-структура в них отсутствует, что согласуется с данными биохимических исследований.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»