WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Рис. 6. Ингибирование салицилатом скорости дыхания митохондрий на -кетоглутарате, описываемая моделью и экспериментальными точками [Л14].

вышеперечисленных механизмов ингибирования салицилатом потока по описываемому сегменту цикла Кребса, рассматривалось влияние как отдельных механизмов ингибирования, так и их совместное действие на стационарный поток. На рис. 7,а показано, как скорость потребления глутамата зависит от его внемитохондриальной концентрации при отсутствии салицилата (кривая 1), при учете отдельных механизмов влияния салицилатов (кривые 2 - 5) и при совместном учете всех механизмов (кривая 6). Анализируя полученные результаты (рис. 7,а), можно заключить, что присутствие реакций, потребляющих CoA, – салицил-CoA лигазы и ацил-CoA-глицин ацилтрансферазы, практически не изменяет потока в цикле Кребса (см. Рис. 7,а, кривая 2). Разобщение окислительного фосфорилирования салицилатами (Рис. 7,а, кривая 3) оказывает незначительный эффект. Тогда как включение по отдельности остальных механизмов значительно снижает поток в цикле. В самом деле, принимая во внимание ингибирование либо кетоглутаратдегидрогеназы (Рис. 7,а, кривая 4), либо сукцинатдегидрогеназы (Рис. 7,а, кривая 5), получаем снижение скорости окисления глутамата практически в 20 раз. Включение всех возможных ингибирующих влияний салицилатов снижает поток почти до нулевого уровня (Рис. 7,а, кривая 6). Таким образом,

а)

1) влияние салицилатов не учитывается;

2) потребление CoA в процессе биотрансформации салицилатов; 3) разобщающее действие салицилатов;

4) ингибирование салицилатом -кетоглутаратдегидрогеназы; 5) ингибирование салицилатом сукцинатдегидрогеназы;

6) учтены все влияния салицилатов (Sal = 5 мМ)

б)

Gluout=20 мМ; KGout=0; Malout=0.5 мМ; Aspout=0

Рис. 7. а) Значимость различных механизмов ингибирования салицилатами цикла Кребса митохондрии, функционирующего на глутамате и малате. Зависимости скорости потребления глутамата от его внемитохондриальной концентрации соответствуют моделям, в которых учтены различные механизмы влияния салицилатов;

б) Зависимость величины потоков через аспартат-глутаматный переносчик (AGC), -кетоглутаратдегидрогеназу (-KGDH) и -кетоглутаратмалатный переносчик (-KMC) от концентрации салицилата.

сравнение различных механизмов ингибирующего эффекта салицилата позволяет заключить, что главным образом этот эффект создается путем ингибирования сукцинатдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы. На рис. 7,б показано, как меняется стационарное распределение потоков в рассматриваемом сегменте цикла Кребса при добавлении салицилата. Видно, что в контроле при нулевой концентрации салицилата практически весь кетоглутарат поглощается кетоглутаратдегидрогеназой (см. схему на Рис. 1), тогда как при увеличении концентрации салицилата поток через кетоглутаратдегидрогеназу (VKGDH) падает, а поток через -кетоглутаратмалатный переносчик (VKMC) увеличивается. Это происходит из-за ингибирования салицилатом двух ферментов нижнего сегмента цикла Кребса (см. Рис. 1), что приводит к перенаправлению потока через -кетоглутаратмалатный шунт.

Предсказание возможных способов предотвращения снижения скорости потребления глутамата в цикле Кребса при воздействии салицилата.

В этом разделе ставится вопрос: возможно ли найти такие изменения концентраций внемитохондриальных субстратов, которые бы позволили увеличить потребление глутамата в цикле Кребса и компенсировать ингибирующее действие салицилата Для решения этой задачи все влияния салицилатов были включены в полную модель (Рис. 1). На рис. 8 показано, что одновременное увеличение концентрации внешнего малата (с 0.495 мМ до 10 мМ), снижение концентрации внешнего кетоглутарата (с 0.54 мМ до нуля) и снижение концентрации внутримитохондриального глицина (с 1 мМ до 1e-4 М) приводит к значительному восстановлению стационарной скорости потребления глутамата аспартатглутаматным переносчиком. Этот результат может быть объяснен следующим образом. Как было показано выше, все механизмы влияния салицилата, кроме разобщающего, воздействуют на нижнюю часть описываемого сегмента цикла Кребса (реакции KGDH, STK, SDH, FUM на Рис. 1) и не влияют на верхнюю часть (реакции AspAT, MDH и KMC). Это означает, что перенаправление потока в цикле Кребса из нижней его части в реакцию-шунт, осуществляемую кетоглутаратмалатным переносчиком, может повлечь повышение потока в цикле Кребса, заингибированном салицилатом. На рис. 8,б показано, что повышение суммарного потока аспартатглутаматного переносчика осуществляется именно за счет перераспределения потоков в пользу кетоглутаратмалатного шунта.

а)

1 – Sal=5 мМ; KGout=0.54 мМ; Malout=0.495 мМ; Aspout=0; Gly=1 мМ;

2 – Sal=5 мМ; KGout=0; Malout=10 мМ; Aspout=0; Gly=0,1 М.

б)

Gluout=20 мМ; KGout=0; Malout=10 мМ; Aspout=0; Gly=0,1 М

Рис. 8. а) Влияние изменения концентраций внемитохондриальных метаболитов на стационарный поток в цикле Кребса при воздействии салицилата;

б) Зависимость величины потоков через аспартат-глутаматный переносчик (AGC), -кетоглутаратдегидрогеназу (-KGDH) и -кетоглутаратмалатный переносчик (-KMC) от концентрации салицилата при реактивации их изменением концентраций метаболитов.

Глава 5. Описание с помощью модели цикла Кребса E.coli in vivo данных и предсказания модели

Значения тех свободных параметров модели цикла Кребса E. coli, функционирующего на ацетате в аэробных условиях, которые не могли быть определены из имеющихся экспериментальных данных, а именно константы равновесия для фосфоенолпируваткарбоксилазы, малик-фермента, киназы/фосфатазы изоцитратдегидрогеназы и константы скорости для суммарной биосинтетической нагрузки, были оценены из in vivo данных по распределению стационарных потоков в цикле Кребса [Л21] как такие значения перечисленных параметров, которые позволили воспроизвести на модели экспериментальные данные. Для этого также пришлось увеличить концентрации изоцитратлиазы, фосфоенолпируваткарбоксилазы и глутаматдегидрогеназы, которые ранее были вычислены по специфической активности клеточного экстракта E. coli. На рис. 9 представлено сравнение распределения потоков, измеренного in vivo (Рис. 9,а) и рассчитанного с помощью модели (Рис. 9,б). Видно, что модель хорошо воспроизводит экспериментально измеренное распределение потоков в цикле Кребса. Также с помощью модели было изучено поведение системы в зависимости от ATPазной и биосинтетической нагрузок и от интенсивности работы дыхательной цепи.

а)

б)

Рис. 9. Распределение потоков в цикле Кребса E. coli, растущей на ацетате аэробно, измеренное экспериментально [Л21] (a) и полученное на модели цикла Кребса E. coli (б). Обозначения как на Рис. 2.

Выводы

1. Построены кинетические модели сегмента цикла Кребса митохондрии, потребляющей глутамат и малат, и цикла Кребса Escherichia coli, растущей на ацетате аэробно, основанные на детальном описании функционирования отдельных ферментов.

2. С помощью модели сегмента цикла Кребса митохондрии получены ответы системы на изменение внешних условий - энергетической и биосинтетической нагрузки клетки. На модели цикла Кребса E.coli получены зависимости стационарных концентраций метаболитов и стационарных потоков от концентрации субстрата ацетата, уровня биосинтетической и ATPазной нагрузки и от уровня потребления NADH комплексом I дыхательной цепи.

3. Показано, что при воздействии салицилата подавление функции митохондрий обусловлено главным образом ингибированием сукцинатдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы. Модель позволяет предсказать, что одновременное увеличение концентрации малата и глутамата и снижение концентрации кетоглутарата в цитозоле, а также снижение концентрации внутримитохондриального глицина приводит к значительному восстановлению стационарной скорости потребления глутамата в результате перераспределения потоков в сегменте цикла Кребса.

4. Модель цикла Кребса E.coli, построенная на основе in vitro экспериментальных данных из различных источников, позволяет описать экспериментальное распределение потоков в цикле при условии увеличения концентраций ферментов изоцитратлиазы, фосфоенолпируваткарбоксилазы и глутаматдегидрогеназы относительно концентраций этих ферментов, рассчитанных из соответствующих специфических активностей экстракта клеток E.coli, выращенных на ацетате.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Могилевская (Зобова) Е.А. Исследование гепатотоксичности салицилатов и поиск способов ее предотвращения с помощью кинетической модели цикла трикарбоновых кислот // Открытый всероссийский конкурс на лучшую научную студенческую работу в разделе медицинские науки. – М. – 2002. – С. 59.

2. Могилевская (Зобова) Е.А. Исследование механизмов гепатотоксичности салицилатов с помощью кинетической модели цикла трикарбоновых кислот / Могилевская (Зобова) Е.А., Демин О.В. // Тезисы докладов 2-го съезда токсикологов России. – М. – 2003. – С. 453.

3. Могилевская Е.А. Кинетическая модель функционирования 2-кетоглутаратдегидрогеназы Escherichia coli / Могилевская Е.А., Лебедева Г.В., Демин О.В. // Российский Биомедицинский журнал Medline.ru – Электрон. журнал. – 2006. – Т. 7, Ст. 44. – С. 442-449.

4. Могилевская Е.А. Кинетическая модель функционирования и регуляции изоцитратдегидрогеназы Escherichia coli / Могилевская Е.А., Лебедева Г.В., Горянин И.И., Демин О.В. // Биофизика. – 2007. – Т. 52, В. 1. – С. 47-56.

5. Могилевская Е.А. Кинетическая модель функционирования цитратсинтазы E. coli / Могилевская Е.А., Лебедева Г.В., Демин О.В. // Математика, Компьютер, Образование. Труды XII международной конференции. – Т. 3. – Пущино, 2005. – С. 934-944.

6. Могилевская (Зобова) Е.А. Кинетическая модель цикла Кребса E.coli / Могилевская (Зобова) Е.А., Лебедева Г.В., Демин О.В. // Математика, Компьютер, Образование. Тезисы XII международной конференции. – Пущино, 2005. – С. 187.

7. Могилевская (Зобова) Е.А., Демин О.В. Кинетическая модель цикла Кребса митохондрии / Могилевская (Зобова) Е.А., Демин О.В. // Российская биоэнергетика: от молекул к клетке. Тезисы конференции. – Москва, 2005. – С. 68.

8. Mogilevskaya E.A. Application of mitochondrial Krebs cycle kinetic modeling to investigate salicylate hepatotoxic effect // Systems Biology: redefining BioThermoKinetics. Trakai. – 2006. – P. 57.

9. Mogilevskaya E.A. Cellular kinetic modeling of the microbial metabolism / Goryanin I.I., Lebedeva G.V., Mogilevskaya E.A., Metelkin E.A., Demin O.V. // Methods Biochem. Anal. - 2006. - V. 49- P. 437-488.

10. Mogilevskaya (Zobova) E.A. Kinetic Model of E.coli Krebs Cycle / Mogilevskaya (Zobova) E.A., Lebedeva G.V., Demin O.V. // Developing Concepts for Systems Biology. 11th Workshop of the BioThermoKinetics Study Group. - Oxford, 2004. - P.55.

11. Mogilevskaya (Zobova) E.A. Kinetic Model of E.coli Krebs Cycle / Mogilevskaya (Zobova) E.A., Lebedeva G.V., Demin O.V. // 12th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, 3rd European Conference on Computational Biology. - Glasgow, 2004. - P.217.

12. Mogilevskaya E.A. Kinetic Model of Mitochondrial Krebs Cycle: Unraveling the Mechanism of Salicylate Hepatotoxic Effects / Mogilevskaya E.A., Demin O.V., Goryanin I. // Journal of Biological Physics. – 2006. - V. 32. - P. 245-271.

13. Mogilevskaya (Zobova) E.A. Kinetic Modelling as a Modern Technology to Explore and Modify Living Cells / Demin O.V., Lebedeva G.V., Kolupaev A.G., Mogilevskaya (Zobova) E.A., Plyusnina T.Yu., Lavrova A.I., Dubinsky A., Goryacheva E.A., Tobin F., Goryanin I.I. // Modelling in Molecular Biology. Natural Computing Series. – Springer, 2004. - P. 59-103.

14. Mogilevskaya (Zobova) E.A. Kinetic modelling of the E. coli metabolism / Demin O.V., Plyusnina T.Y., Lebedeva G.V., Mogilevskaya (Zobova) E.A., Metelkin E.A., Kolupaev A.G., Goryanin I.I., Tobin F. // Topics in Current Genetics. – Springer, 2005. - P. 31-67.

Литература

[Л1] Edwards J.S., Ibarra R.U., Palsson B.O. In silico predictions of Escherichia coli

metabolic capabilities are consistent with experimental data // Nat. Biotechnol. – 2001. – V.19. – P.125-130.

[Л2] Demin O.V., Lebedeva G.V., Kolupaev A.G., Zobova E.A., Plyusnina T.Yu., Lavrova A.I., Dubinsky A.Yu., Goryacheva E.A., Tobin F., Goryanin I.I. Kinetic Modelling as a Modern Technology to Explore and Modify Living Cells // Modelling in Molecular Biology. Natural Computing Series. - Springer, 2004. - P.59-103.

[Л3] Krebs H.A., Johnson W.A. The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues // Enzymologia. - 1937. - N.4. - P.148-156.

[Л4] Кондрашова М.Н. Структурно-кинетическая организация цикла трикарбоновых кислот при активном функционировании митохондрий // Биофизика. – 1989. - Т. 34, вып. 3. - С.450-457.

[Л5] Chance B.C., Hollunger G. The Interaction of Energy and Electron Transfer Reactions in Mitochondria. I. GENERAL PROPERTIES AND NATURE OF THE PRODUCTS OF SUCCINATE-LINKED REDUCTION OF PYRIDINE NUCLEOTIDE // J. Biol. Chem. - 1961. - V. 236. - P.1534-1543.

[Л6] Parlo R.A., Coleman P.S. Enhanced Rate of Citrate Export from Cholesterol-rich Hepatoma Mitochondria // J. Biol. Chem. – 1984. – V. 259, N. 16. – P.9997-10003.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»