WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Ранее был построен ряд математических моделей разной степени детализации для изучения функционирования цикла Кребса. В работах Е.Е. Селькова и соавт. [Л16], а также в работе R. Ramakrishna et al. [Л17], исследовалась лишь стехиометрия системы. В работах группы В.В. Дынника [Л18] изучались различные регуляторные механизмы в
цикле Кребса. Также были разработаны детальные модели, включающие описание кинетики ферментов [Л19]. Спектр моделей цикла Кребса E. coli не так широк [Л20]. С помощью этих моделей были выявлены особенности работы и регуляции цикла Кребса, однако к их недостаткам можно отнести произвольную запись уравнений скорости, которые не отражают механизмов каталитических циклов ферментов, а также отсутствие учета действия некоторых эффекторов на ферменты. Также в перечисленных работах значения параметров, входящих в уравнения скорости, которые не могут быть измерены в эксперименте, выбираются произвольным образом. Представленный в данной работе подход основан на выводе уравнений скорости ферментов согласно механизмам их работы, учете известных регуляторных связей в цикле Кребса, а также определении неизвестных параметров из литературных экспериментальных данных, что позволяет делать более достоверные выводы и предсказания.

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Кинетическая модель сегмента цикла Кребса митохондрии, потребляющей глутамат и малат.

Кинетическая модель представляет собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений, которая в каждый момент времени определяет состояние рассматриваемой системы химических реакций, т.е. задает концентрации метаболитов этой совокупности реакций как функции времени [Л22]:

(2.1)

Здесь X – концентрация метаболита, и - суммарные скорости его продукции и потребления.

Построенная математическая модель сегмента цикла Кребса митохондрии описывает потребление глутамата и малата как субстратов (см. схему цикла на рис. 1). Переменными модели являются: Gluin, Aspin, OAA, KGin, SucCoA, СoA, Suc, Fum, Malin, SDH, SDH-OAA. Концентрации Gluout, Aspout, Hout, Hin, Malout, KGout, P, ATP, ADP, Ca2+, GTP, GDP, Q, QH2, NAD,

Обозначения:

AGC-аспартат-глутаматный переносчик; AspAT-аспартат-аминотрансфераза; KGDH- -кетоглутаратдегидрогеназа;

STK-сукцинаттиокиназа; SDH-сукцинатдегидрогеназа; FUM-фумараза; MDH-малатдегидрогеназа; KMC--кетоглутарат-малатный переносчик; ISDH-реакция связывания оксалоацетата с сукцинатдегидрогеназой; SL-салицил-CoA лигаза; SGT – салицил-CoA-глицин ацилтрансфераза; Gluin – внутримитохондриальный глутамат; Aspin – внутримитохондриальный аспартат; OAA - оксалоацетат, KGin - внутримитохондриальный -кетоглутарат, SucCoA - сукцинилКоА, CoA – коэнзим А, Suc - сукцинат, Fum - фумарат, Malin – внутримитохондриальный малат. Пунктиром обозначены ингибирующие воздействия салицилата (Sal).


Рис 1. Схема сегмента цикла Кребса, потребляющего глутамат и малат при активном функционировании митохондрий, с учетом влияния салицилата.

NADH не изменяются со временем, т.е. являются параметрами модели. Модель сегмента цикла Кребса митохондрии описывается системой обыкновенных дифференциальных уравнений (2.1) в соответствии со схемой (Рис. 1). Например, изменение концентрации внутримитохондриального -кетоглутарата во времени определяется следующим образом:

(2.2)

В системе существует четыре уравнения детального баланса:

(сохранение азота аминогрупп);

(сохранение коэнзима А);

(сохранение четырехуглеродного скелета);

(сохранение сукцинатдегидрогеназы).

2.2 Кинетическая модель цикла Кребса E.coli.

Схема функционирования цикла Кребса E. coli при аэробном росте на

ацетате представлена на Рис. 2. Поскольку при росте E. coli в таких

Рис. 2. Схема функционирования цикла Кребса E.coli при аэробном росте на ацетате.

Обозначения: ack - Ацетаткиназа; pta - Фосфотрансацетилаза; gltA - Цитратсинтаза; acn - Аконитаза; icd,IDH - Изоцитратдегидрогеназа; aceK - Киназа/Фосфатаза IDH; sucAB,lpd - 2-кетоглутаратдегидрогеназа; sucCD – СукцинилКоА-лигаза; sdhABCD - Сукцинатдегидрогеназа; fumA - Фумараза; mdh - Малатдегидрогеназа; aceA - Изоцитратлиаза; aceB - Малатсинтаза; PEPCL - Фосфоенолпируваткарбоксилаза; ME – Малик-фермент; GDH - Глутаматдегидрогеназа; cI – комплекс I; Bs – NADPH потребление на биосинтезы; As – ATP-синтаза; Al – ATP нагрузка. Пунктирные стрелки с острыми концами обозначают активирующие влияния, а пунктирные стрелки с тупыми концами – ингибирующие влияния метаболитов на ферменты.

условиях экспрессируются ферменты глиоксилатного шунта – изоцитратлиаза (aceA) и малатсинтаза (aceB) – появляется разветвление на уровне изоцитрата, который потребляется либо изоцитратдегидрогеназой (icd, IDH), либо изоцитратлиазой. Распределение изоцитрата между этими двумя реакциями регулируется киназой/фосфатазой IDH (aceK). Если большая часть IDH фосфорилирована, т.е. является неактивной (IDHP), изоцитрат в основном направляется в глиоксилатный шунт для пополнения сукцината (Suc) и малата (Mal), расходуемых на биосинтезы. С другой стороны, если IDH находится в нефосфорилированной (активной) форме, изоцитрат поступает в нижний сегмент цикла Кребса и дважды декарбоксилируется ферментами IDH и KGDH. В последнем случае цикл Кребса реализует свою энергетическую функцию, обеспечивая восстановительными эквивалентами дыхательную цепь. Функционирование aceK как киназы/фосфатазы, в свою очередь, регулируется уровнями таких центральных метаболитов как AMP, пируват (Pyr), 3-фосфоглицерат (PG) [Л23]. Также в модель входят оттоки из малата – малик-фермент (ME), оксалоацетата – фосфоенолпируваткарбоксилаза (PEPCL), 2-кетоглутарата (KG) – глутаматдегидрогеназа (GDH). Учтены также реакции окисления NADH дыхательной цепью, потребление NADPH на биосинтезы, синтез ATP ATP-синтазой и потребление ATP на клеточные нужды. Переменными модели являются AcP, AcCoA, CoA, OAA, Cit, Aco, iCit, KG, NADP, NADPH, IDH, IDHP, сукцинил-КоА (SucCoA), NAD, NADH, ADP, ATP, Suc, фумарат (Fum), Mal, глиоксилат (Glx). Концентрации протонов (H), P, Q, QH2, PEP, PG, AMP, Pyr не изменяются со временем, т.е. являются постоянными параметрами модели. Модель цикла Кребса E. coli описывается системой обыкновенных дифференциальных уравнений (2.1), в которой изменение во времени каждой переменной определяется в соответствии со схемой (Рис. 2). Например, уравнение, определяющее концентрацию оксалоацетата, записывается следующим образом:

(2.3)

В системе содержатся пять уравнений детального баланса:

(сохранение адениновых нуклеотидов);

(сохранение пиридиновых нуклеотидов);

(сохранение кофермента А);

(сохранение фосфорилированных пиридиновых нуклеотидов);

(сохранение изоцитратдегидрогеназы).

2.3 Методы описания ферментов цикла Кребса в моделях.

Для описания механизмов функционирования отдельных ферментов использовались литературные экспериментальные данные по изучению очищенных ферментов in vitro. Вывод уравнений скорости реакций ферментов основывался на принципах квазистационарного состояния и/или быстрого равновесия [Л24] и состоял из нескольких этапов:

  1. Построение каталитического цикла фермента;
  2. Вывод уравнения стационарной скорости реакции, катализируемой ферментом, с использованием параметров каталитического цикла (констант скоростей и констант диссоциации/равновесия отдельных элементарных реакций каталитического цикла);
  3. Вывод соотношений, связывающих кинетические параметры ферментативной реакции (константы Михаэлиса, константы ингибирования, каталитические константы и др.) с параметрами каталитического цикла;
  4. Вывод уравнения скорости с использованием классических кинетических параметров ферментативной реакции.

После того как уравнения скорости были выведены, определялись значения фигурирующих в них кинетических параметров. Этот процесс также состоял из нескольких этапов:

  1. В литературе были найдены все доступные экспериментальные данные по исследованию кинетических свойств данного фермента in vitro. Эти данные представляют собой либо зависимости начальной скорости работы фермента от концентраций субстратов, продуктов, эффекторов, либо зависимости изменения концентраций субстратов и/или продуктов рассматриваемой ферментативной реакции от времени, а также данные по изотопному обмену, происходящему в присутствии фермента;
  2. Для количественного описания экспериментов строилась кинетическая минимодель с использованием выведенного уравнения скорости работы фермента. Например, для описания экспериментально полученных зависимостей начальных скоростей от концентраций субстратов, продуктов и эффекторов минимоделью являлось выведенное ранее уравнение скорости, а для описания экспериментальных зависимостей субстратов (продуктов) ферментативной реакции от времени в качестве минимодели использовалась система обыкновенных дифференциальных уравнений, в правую часть которой входило уравнение скорости рассматриваемого фермента;
  3. Значения параметров уравнения скорости определялись из условия наилучшего совпадения экспериментальных данных с соответствующими им результатами численного решения минимоделей. Для этого использовалась программа DBSolve7.0 [Л25], в которой реализована идентификация параметров по алгоритму Hook–Jeeves [Л26].

2.4 Методы исследования поведения моделей цикла Кребса.

Модели цикла Кребса исследовались также с помощью программы DBSolve 7.0 [Л25], которая, используя методы численного интегрирования, по заданной системе дифференциальных уравнений, описывающей модель, и заданным начальным условиям позволяет получать зависимости переменных от времени. Изучалась также зависимость стационарной скорости цикла от различных параметров.

Глава 3. Описание кинетики ферментов цикла Кребса

В этой главе дается подробное описание кинетики ферментов цикла Кребса митохондрии и E. coli, вывод уравнений скорости работы ферментов и определения параметров, входящих в уравнение, согласно алгоритму, приведенному в Главе 2. Учтено влияние ингибиторов и активаторов на ферменты. Для тех ферментов цикла Кребса E. coli, по которым в литературе имелись данные о зависимости их активности от pH, мы вводили в уравнение скорости pH-зависимость, что позволило объединять разнородные экспериментальные данные по исследованию фермента in vitro при разных pH. Например, функционирование 2-кетоглутаратдегидрогеназы E. coli описывалось в соответствии с необратимым механизмом Ping Pong. Субстратное ингибирование фермента 2-кетоглутаратом [Л27] было описано с помощью введения в модель двух центров связывания 2-кетоглутарата, между которыми существует кооперативное взаимодействие. Схема каталитического цикла приведена на Рис. 3. Кроме того, мы описали

Обозначения:

E1, E2, E3 – состояния фермента;

E1,0- депротонированная форма фермента E1; E1,2- дважды протонированная форма фермента E1.

Рис. 3. Схема каталитического цикла 2-кетоглутаратдегидрогеназы E. coli.

зависимость активности фермента от pH, исходя из классического предположения [Л24], что фермент может протонироваться в активном центре, причем активной является единожды протонированная форма, а депротонированная и дважды протонированные формы являются неактивными. На Рис. 3 показано протонирование свободной формы фермента Е1; таким же образом происходит протонирование всех других форм фермента. Уравнение скорости фермента было выведено согласно каталитическому циклу (Рис. 3) в следующем виде:

(3.1)

Константы отщепления ионов водорода от их комплекса с ферментом были определены по экспериментальным данным [Л28] (см. Рис. 4).

Рис. 4. Зависимость максимальной активности 2-кетоглутаратдегидрогеназы от pH, представленная экспериментальными точками [Л28], и описываемая кривой согласно уравнению скорости (3.1) при t=25oC.

Ряд неизвестных параметров определялся из экспериментальных данных [Л27] (см. Рис. 5).

CoA=0.5 мМ; NAD=3 мМ; KGDH=5.3 нМ; pH7.0; t=4oC

Рис. 5. Зависимость начальной скорости 2-кетоглутаратдегидрогеназной реакции от концентрации 2-кетоглутарата, представленная экспериментальными точками [Л27] и описываемая теоретической кривой согласно уравнению скорости (3.1).

Глава 4. Исследование функционирования цикла Кребса при повышенной активности митохондрий и влияния на него салицилата с помощью модели

После того как модель сегмента цикла Кребса митохондрии, в котором потребляются глутамат и малат, была построена, исследовались ответы системы на изменение внешних условий. Было показано, как зависит скорость работы такого укороченного цикла Кребса от ATPазной нагрузки и степени восстановленности пиридиновых нуклеотидов.

Для описания эффекта салицилата на энергетический метаболизм использовались литературные экспериментальные данные. Были найдены данные о том, как изменяется трансмембранный потенциал и pH в митохондрии при воздействии салицилата. Константы ингибирования салицилатом двух ферментов цикла Кребса (-кетоглутаратдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы) определялись из описания полной моделью экспериментальных данных по влиянию салицилата на дыхание суспензии митохондрий (см. Рис. 6). Для того чтобы оценить вклад каждого из

1) KGout=10 мМ, pHout =7.4, T=30oC; (белые квадраты)

2) KGout=10 мМ, pHout =7.4, T=30oC, Sal=6,7 мМ (черные квадраты).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»