WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Могилевская Екатерина Александровна

Теоретическое исследование механизмов функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli

03.00.02 – Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Красноярск – 2007

Работа выполнена в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Института физико-химической биологии им.

А.Н. Белозерского

Олег Владимирович Демин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Мария Николаевна Кондрашова

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Института биофизики СО РАН

Юрий Леонидович Гуревич

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится «06» ноября 2007 г. в 1000 ч. мин. на заседании Диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 600036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан «15» августа 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук Н.С. Кудряшева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается существенный прогресс в области молекулярно-биологических и генетических исследований бактерии Escherichia coli и других организмов. Клеточный метаболизм, включающий взаимопревращения тысяч молекул в виде катализируемых ферментами биохимических реакций, - очень активно изучаемая сейчас система. Для большинства биохимических путей в E. coli известны все молекулы-метаболиты и стехиометрия их взаимопревращений, т.е. имеется так называемая статическая информация о последовательности реакций и о том, какие молекулы и в каких количествах в них участвуют. В данной ситуации может возникнуть иллюзия, что статической информации достаточно для предсказания функционирования биохимических путей при решении фундаментальных и прикладных (например, биоинженерных) задач. Отчасти, это действительно так – в некоторых случаях возможно сделать предсказания на основе только статической информации [Л1]. Однако, как правило, такой подход не оправдывает себя, поскольку внутриклеточные процессы определяются не только последовательностью реакций, но и регуляторными влияниями интермедиатов на ферменты, и генетической регуляцией уровней экспрессии ферментов, что позволяет клетке адаптироваться к изменениям внешней среды. Регуляторные механизмы в клетке ответственны за поддержание гомеостаза и переходы между различными физиологическими состояниями метаболизма. Вот почему крайне важно включать в модели регуляторные механизмы метаболических путей. Для построения таких моделей в данной работе был использован подход кинетического моделирования [Л2], который может быть, в частности, применен для изучения побочных эффектов лекарств. На основе данных по стехиометрии и регуляторным механизмам могут быть реконструированы внутриклеточные процессы, на которые лекарство оказывает негативное действие. Как правило, лекарства имеют множественные эффекты на внутриклеточный метаболизм, например, несколько ферментов могут быть активированы или ингибированы, а также ряд ферментов может быть вовлечен в экскрецию лекарства. Проблема выявления главных и второстепенных механизмов токсического действия лекарств не может быть решена только экспериментально, т. к. анализ различных влияний требует их избирательного выключения, а это, как правило, невозможно сделать в эксперименте. Кинетическое моделирование позволяет исследовать каждый эффект в отдельности и понять, какой из них имеет больший вклад в общий побочный эффект.

Цель данной работы заключалась в выявлении и описании с помощью кинетических моделей особенностей функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli.

Для достижения поставленной цели в рамках настоящей работы решались следующие основные задачи:

  1. Разработать кинетические модели цикла Кребса митохондрии, потребляющей глутамат и малат, и Escherichia coli, растущей на ацетате аэробно, основанные на детальном описании функционирования отдельных ферментов.

2. Получить с помощью кинетических моделей цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli ответы системы на изменение внешних условий - энергетической и биосинтетической нагрузки клетки.

3. Промоделировать совместное и изолированное влияние отдельных механизмов ингибирования салицилатом цикла Кребса для выявления среди них критических и предложить способы восстановления стационарной скорости в цикле Кребса, сниженной салицилатом.

4. Показать, возможно ли, объединяя в модели in vitro экспериментальные данные из различных источников, описать измеренное in vivo распределение потоков в цикле Кребса E. coli, потребляющей ацетат как источник углерода.

Научная новизна. Впервые разработана кинетическая модель сегмента цикла Кребса митохондрии, который функционирует в состоянии повышенной активности митохондрий, на основе информации об отдельных ферментах. Значения кинетических параметров, входящих в уравнения скорости, оценены по in vitro литературным экспериментальным данным. Концентрации ферментов определены из экспериментальных данных по дыханию суспензии митохондрий на глутамате и малате. На модели изучены эффекты салицилата на энергетический метаболизм митохондрии. Было показано, что ингибирование сукцинатдегидрогеназы и -кетоглутаратдегидрогеназы вносит существенный вклад в общее ингибирующее действие салицилата, тогда как разобщение окислительного фосфорилирования и потребление коэнзима А в реакциях трансформации салицилата незначительно влияют на скорость окисления субстратов в цикле Кребса. Модель позволяет предсказать, что заингибированный салицилатом поток в цикле Кребса может быть увеличен путем перераспределения потоков в цикле увеличением концентраций внемитохондриальных глутамата и малата и снижением концентраций внемитохондриального -кетоглутарата и внутримитохондриального глицина. Разработана также детальная кинетическая модель цикла Кребса Escherichia coli, растущей на ацетате аэробно. На основе in vitro данных дано подробное описание функционирования и регуляции ферментов полного цикла Кребса и глиоксилатного шунта, учтена регуляция изоцитратдегидрогеназы путем фосфорилирования. С помощью модели показано, как будет изменяться распределение потоков между циклом Кребса и глиоксилатным шунтом при изменении энергетической и биосинтетической активностей клетки.

Практическое значение. С помощью построенной модели сегмента цикла Кребса митохондрии, функционирующей при повышенном энергопотреблении, изучено ингибирующее влияние салицилата на стационарный поток по циклу Кребса и предложены возможные способы предотвращения его уменьшения. На модели цикла Кребса Escherichia coli показана возможность объединения in vitro экспериментальных данных по отдельным ферментам для описания поведения системы in vivo. Предложенный подход кинетического моделирования позволяет решать практические фармакологические (показать, как можно уменьшить токсические эффекты уже существующих лекарств, а также предсказать возможные побочные эффекты новых лекарственных веществ, которые находятся в стадии разработки) и биоинженерные задачи.

Апробация работы. Результаты диссертации докладывались на 2 съезде токсикологов России (Москва, 2003), на 3 европейской конференции по вычислительной биологии (Глазго, 2004), на 11 и 12 международных конференциях по биотермокинетике (Оксфорд, 2004, Тракай, 2006), на 12 международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2005), на конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005).

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав исследований, заключения и списка литературы. Работа представляет собой рукопись на 166 страницах, включая 57 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В первой главе представлен обзор литературы, посвященной структуре цикла Кребса, гепатотоксическому действию салицилатов и математическим моделям цикла Кребса митохондрии и E. coli.

Цикл трикарбоновых кислот – это заключительный общий путь окисления молекул-источников энергии: углеводов, аминокислот и жирных кислот, обеспечивающий генерирование ATP. Кольцевая стехиометрия цикла трикарбоновых кислот была установлена Х.А. Кребсом и У.А. Джонсоном в 1937 году [Л3]. К настоящему времени накоплен большой массив данных, описывающих отдельные стадии цикла. Для всех ферментов имеются экспериментально полученные зависимости скорости реакций от концентраций субстратов, продуктов, изучена регуляция отдельных ферментов интермедиатами цикла. Для многих ферментов предложены возможные механизмы их функционирования, описывающие экспериментальные данные.

Функционирование цикла Кребса в целом также изучалось экспериментально и теоретически. Было установлено, что субстратами цикла Кребса могут быть различные субстраты - сукцинат, глутамат, малат, -кетоглутарат, а также пируват, жирные кислоты и аминокислоты - источники молекулы ацетил-коэнзима A. Известно, что в состоянии покоя и активности ткани окисление субстратов в митохондриях может идти не по идентичным маршрутам. Один из субстратов ЦТК – янтарная кислота (сукцинат) – по интенсивности окисления и аккумуляции энергии резко превышает остальные. Кинетическое преимущество окисления сукцината особенно важно при энергетических затратах. М.Н. Кондрашовой было показано [Л4], что при активной деятельности происходит переключение на преимущественное использование сукцината. Активация обмена в организме (мышечной нагрузкой, стрессом, введением катехоламинов, гипоксическим или холодовым воздействием, при пробуждении от спячки) приводит к избирательному усилению окисления и образования сукцината, в то время как окисление НАД-зависимых субстратов не меняется. Показано, что эффективность использования сукцината, образующегося в митохондриях из -кетоглутарата, приблизительно в 100 раз выше, чем добавляемого в среду инкубации [Л5]. В 1989 г. М.Н. Кондрашовой [Л4] был рассмотрен путь притока высокоэффективного сукцината через сукцинил-КоА из -кетоглутарата, образующегося не через участок лимонных кислот ЦТК, а путем переаминирования глутамата и оксалоацетата, осуществляемого глутамат-оксалоацетат трансаминазой. Этот путь является важным путем интенсивного образования сукцината при активации функций митохондрии, в частности при напряжении, связанном с патологическими процессами. Модель именно такого варианта функционирования цикла Кребса была разработана в данной работе для изучения побочных эффектов салицилата. Существование такого укороченного цикла Кребса было показано в митохондриях гепатомы Морриса 3924A [Л6]. В ряде экспериментальных работ [Л7] было также установлено, что митохондриальный цикл Кребса может функционировать в отличном от традиционного варианте.

Функционирование цикла Кребса в бактериях и, в частности, в Escherichia coli, также изучено достаточно полно. При аэробном росте E. coli на ацетате наблюдается экспрессия всех ферментов цикла Кребса, а также ферментов глиоксилатного шунта [Л8]. В этом случае два атома углерода молекулы ацетата не потребляются полностью в декарбоксилирующих реакциях цикла Кребса, а частично направляются в глиоксилатный шунт для использования в биосинтетических процессах [Л9]. После формирования изоцитрата поток углерода разделяется между изоцитратдегидогеназой и изоцитратлиазой. Распределение изоцитрата между этими двумя реакциями регулируется обратимым фосфорилированием изоцитратдегидрогеназы ее киназой/фосфатазой. Этот белок, в свою очередь, подвержен влиянию ряда центральных метаболитов, чьи концентрации служат сигналами энергетической и биосинтетической потребностей клетки.

В настоящей работе кинетическая модель сегмента цикла Кребса митохондрии, функционирующего при потреблении глутамата и малата, применялась для изучения гепатотоксических эффектов салицилата, который относится к группе нестероидных противовоспалительных средств (НПВС). В то время как механизмы возникновения язвообразования при его применении достаточно хорошо изучены, изменения в клетке, развивающиеся при токсических воздействиях, в частности, на печень, остаются не до конца выясненными. Из литературы известно, что большие дозы аспирина могут приводить к некрозу гепатоцитов, развитию истинной печеночной недостаточности, к последующей эндогенной интоксикации, печеночной коме и смерти [Л10]. Поражение печени как побочный эффект может проявляться и при применении аспирина и других салицилатов в терапевтических дозах [Л11]. Одной из причин этих тяжелых последствий являются нарушения в функционировании и регуляции энергетического метаболизма гепатоцитов, в частности, цикла Кребса. В процессе метаболизма в печени аспирин и его производные могут ингибировать -окисление жирных кислот [Л12], уменьшать пул кофермента А [Л13], ингибировать -кетоглутаратдегидрогеназу и сукцинатдегидрогеназу [Л14]. Известно также, что салицилаты повышают проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, уменьшая тем самым трансмембранный потенциал [Л15]. Все эти негативные воздействия могут приводить к нарушениям энергетического метаболизма.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»