WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Методы изучения функции ГАС. Дексаметазоновый тест применялся для оценки торможения активности ГАС по механизму отрицательной обратной связи. В этом стандартном тесте, широко используемом в клинике, применяют введение синтетического аналога глюкокортикоидных гормонов – дексаметазона (Carrol, 1982). Дексаметазон вводился животным внутрибрюшинно в дозе 5 мкг/кг. В качестве оценочного показателя функционирования механизмов обратной связи использовали изменения уровня кортикостерона в плазме крови в ответ на введение дексаметазона. Тест проводили в течение двух дней: на третьи и четвёртые сутки после экспозиции животных неизбегаемому стрессу в парадигме «выученная беспомощность».

Состояние конечного звена ГАС у крыс в разные сроки развития патологий оценивали путем определения содержания основного глюкокортикоидного гормона крыс кортикостерона в плазме крови. Содержание кортикостерона в плазме крови определялось с помощью радиоиммунологического метода (Морозов и др., 1988).

Методы изучения поведения. Мониторинг поведения животных в ходе развития тревожно-депрессивных состояний в рассматриваемых моделях производили в тестах «открытое поле» (Holl, 1936; Маркель, 1988) и приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (Pellow et al., 1985).

Тесты с применением антидепрессантов. Эффективная коррекция введением селективных антидепрессантов, применяемых для лечения соответствующих патологий в клинике, служила доказательством соответствия индуцированных в нашей работе тревожно-депрессивных расстройств экспериментальным формам эндогенной депрессии и ПТСР. Для коррекции постстрессовой депрессии в парадигме «выученная беспомощность» использовали раствор мапротилина метансульфоната (людиомил, Novartis Pharma, USA), который вводили каждому животному в дозе 15 мкг/кг внутрибрюшинно. Инъекции производились каждый день в течение 3 дней после экспозиции животных неизбегаемому стрессу. Эффект антидепрессанта на поведение и уровень кортикостерона оценивался соответственно на 5- и 10-й день после стрессорного воздействия.

В экспериментах по терапевтической коррекции экспериментального ПТСР был использован современный антидепрессант-анксиолитик паксил (пароксетина гидрохлорид, GlaxoSmithKline, UK). Паксил в виде суспензии на физиологическом растворе вводили каждому животному в дозе 20 мг/кг перорально, трехкратно – на 4-й, 5-й, 6-й день после травматического стресса. Корректирующий эффект паксила на поведение наблюдали в открытом поле на 1-е сутки после повторного стресса (рестресса), в тесте ПКЛ – на 5-е сутки после рестресса.

Иммуноцитохимический метод. Содержание CRH и вазопрессина в гипоталамусе и экстрагипоталамических структурах мозга, осуществляющих регуляцию ГАС, определялось с помощью иммуноцитохимического метода с использованием соответствующих антител. Для этого мозг животного быстро извлекался из черепной коробки, и выделенные гипоталамическая и экстрагипоталамическая области мозга помещалась в фиксатор – 4-% раствор параформальдегида в 0,4 М фосфатном буфере. Фиксация проводилась при температуре 0-4оС в течение 36-48 часов. Далее проводилась стандартная гистологическая обработка ткани, которая заключалась в проводке материала. Затем материал заливался в парафиновые блоки. Изготавливались чередующиеся срезы структур мозга во фронтальной плоскости толщиной 5-6 нм: 3,3 – 3,8 мм от брегмы для области мозга гиппокамп+фронтопариетальный неокортекс, 1,8 мм от брегмы – для гипоталамической области мозга (Paxinos and Watson, 1997). С помощью метода немеченых антител (авидин-биотинового) и иммунопероксидазной реакции проводили выявление CRH- и вазопрессин-иммунореактивного вещества (антигенов). Использовались первичные поликлональные антитела кролика к CRH (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA; 1:100) и вазопрессину (Abcam, UK; 1:500). Иммуногистохимическая реакция (двухэтапный метод с демаскировкой антигена) проводилась по стандартной схеме (Хериет и Гаттер, 1999). Для визуализации иммунной реакции использовали диаминобензидин. Уровень экспрессии CRH и вазопрессина оценивали в паравентрикулярном ядре гипоталамуса, CRH – также в аммоновом роге гиппокампа (полях СА1, СА3-4) и зубчатой извилине, во фронтопариетальной коре количественно на основании измерения оптической плотности окрашенного вещества в клетках [Smolen, 1990; Эллиниди и др., 2002] с помощью компьютерного цифрового анализатора изображения, включающего световой микроскоп Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровую камеру Baumer CX05c (Baumer Optronic, Germany), компьютер и программное обеспечение Video Test Master Morphology (разработка ООО “Видео Тест”, Санкт-Петербург). Анализировали общее число иммунореактивных клеток и суммарное число средне- и интенсивно окрашенных клеток.

Для статистической обработки данных применялся однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA, пакет анализа STATISTICA 6.0). Различия между выборками считали значимыми при р0,05. Результаты представлены в виде среднего арифметического ± ошибка среднего (SEM), а также в процентах от значений в контрольных группах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика депрессивноподобного состояния, развивающегося у крыс Вистар в модели «выученная беспомощность». У животных в парадигме «выученная беспомощность» развивалось устойчивое депрессивноподобное состояние, характеризующееся двигательной ретардацией (рис. 1, А-Б) и повышенной тревожностью (рис. 1, В). В данной модели также воспроизводились эндокринные нарушения, специфичные для эндогенной депрессии. В частности, у животных после экспозиции неизбегаемому стрессу наблюдался повышенный уровень кортикостерона (115,2±7,79 нмоль/л в контрольной группе vs. 247,5±35,99 нмоль/л в опытной группе; F1,14=5,93, р=0,04) и нарушение торможения ГАС по механизму отрицательной обратной связи, о чём свидетельствуют результаты дексаметазонового теста (табл. 1). Антидепрессант людиомил оказывал существенный тимоаналептический эффект. Это проявлялось в значимом увеличении двигательной активности (F1,10=9,75; р=0,018), снижении времени неподвижности в открытом поле (F1,10=5,26; р=0,05) животных, которым инъецировался антидепрессант, по сравнению с депрессивными животными, не получавшими инъекции людиомила. Также была отмечена нормализация уровня кортикостерона у животных в группе, получавшей антидепрессант (F1,10=7,18; р=0,03).

Динамика экспрессии кортиколиберина в структурах мозга, участвующих в регуляции ГАС, при развитии депрессивноподобного состояния в модели «выученная беспомощность». Обнаружено устойчивое повышение экспрессии CRH в гипоталамусе крыс в ходе развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность». В мелкоклеточной части паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВЯ) было выявлено существенное увеличение общего количества CRH-иммунореактивных клеток (рис. 2) и числа средне- и интенсивно- экспрессирующих клеток на всех исследованных сроках формирования депрессивноподобного состояния (с 1-го по 10-й день после экспозиции животных неизбегаемому стрессу). В частности, наблюдалось увеличение общего количества CRH-иммунореактивных клеток на 113% (F1,12=28,5; р<0,001), и числа средне- и интенсивно- окрашенных клеток – на 243% (F1,12=63,28; р<0,001) относительно контроля на 10-й постстрессорный день.

Выявлено увеличение экспрессии CRH во всех исследованных полях гиппокампа к 10-му дню развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность» (рис.3). В поле СА1 отмечено значимое увеличение общего количества CRH-иммунореактивных клеток на 10-й постстрессорный день на 42,3% относительно контрольного уровня (F1,12=10,76; р=0,008), в поле СА3-4 – на 34,3% (F1,12=6,95; р=0,02), в зубчатой извилине – на 62,2% относительно контроля (F1,12=8,13; р=0,01). В неокортексе не выявлено значимых изменений экспрессии нейрогормона на 10-й день после стресса, когда депрессивноподобное состояние уже сформировалось.

Изменения экспрессии вазопрессина в гипоталамусе крыс Вистар при развитии депрессивноподобного состояния в модели «выученная беспомощность». Устойчивых изменений содержания иммунореактивного вазопрессина в CRH-ергических нейросекреторных ядрах гипоталамуса не выявлено. Однако наблюдалось транзиторное снижение экспрессии нейрогормона в ПВЯ гипоталамуса на 1-е сутки после экспозиции животных неизбегаемому стрессу (F1,12=45,31; р<0,0001) с последующей нормализацией этого показателя (рис. 4).

Таким образом, в наших исследованиях была установлена гиперактивация гипоталамического и некоторых структур экстрагипоталамического контура CRH-системы в экспериментальной модели эндогенной депрессии. Можно предположить, что именно активация гипоталамического звена системы, причем преимущественно его мелкоклеточной части, где CRH функционирует как активатор ГАС, лежит в основе наблюдаемых изменений функции ГАС, в частности, повышения уровня кортикостерона и нарушения регуляции ГАС по механизму отрицательной обратной связи. Вазопрессин, вероятнее всего, не вовлечён в формирование поведенческой депрессии и характерных нарушений функции ГАС у крыс в рассмотренный период развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность».

Рис. 1. Поведение крыс Вистар в открытом поле и ПКЛ после неизбегаемого стресса в парадигме «выученная беспомощность». А – горизонтальная двигательная активность в открытом поле; Б – время неподвижности (замираний) в открытом поле; В – индекс тревожности контрольных (светлые столбики) и подопытных (тёмные столбики) животных: 1/время пребывания в открытых рукавах ПКЛ.

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Табл. 1. Базальный и стрессорный уровни кортикостерона в плазме крови (в нмоль/л) контрольных и подопытных животных после введения физиологического раствора и после введения дексаметазона. Время отсчитывается от начала первого забора крови (0`- базальный уровень гормона, 30`- через 30 мин после первого забора, т.е. стрессорный уровень гормона).

время, мин.

0'

0'-

дексаметазон

% (0')

30'

30'- дексаметазон

% (30')

контроль

203,0±43,34

52,0±10,12

74,37

787,9±144,99

161,3±48,06

79,5

опыт

385,3±41,28

265,0±47,45

31,2 *

743,1±49,91

586,2±31,44

21,1*

%, величина подавления, обозначенная в процентах от исходного уровня кортикостерона;

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Рис.2. Динамика экспрессии кортиколиберина (общее количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля) в мелкоклеточной (светлые столбики) и крупноклеточной (тёмные столбики) частях паравентрикулярного ядра гипоталамуса крыс Вистар на разных сроках развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность». Пунктирной линией обозначен уровень экспрессии контрольной группы, принятый за 100%.

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Рис. 3. Динамика экспрессии кортиколиберина (общее количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля) в полях гиппокампа крыс Вистар на разных сроках развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность». Пунктирной линией обозначен уровень экспрессии контрольной группы, принятый за 100%.

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Рис.4. Динамика экспрессии вазопрессина (общее количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля – пунктирная линия), в мелкоклеточной (светлые столбики) и крупноклеточной (тёмные столбики) частях паравентрикулярного ядра гипоталамуса крыс Вистар на разных сроках развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность».

* - значимые отличия от контроля,

р <0,05.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»