WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Несмотря на сделанное выше утверждение, в некоторых случаях Ag+ бэнды не соответствовали активным ЯО районам (Dobigny et al., 2002). Описанные выше данные позволяют предположить, что дополнительно Ag+ бэнды могут быть не связаны с ЯО районами, а представляют собой районы с высоким содержанием кислых белков. Однако следует обратить внимание на Ag+ бэнды на концах хромосомы tu, где, как мы покажем, у S. araneus локализованы ЯО районы. Возможно, что на концах этой хромосомы также локализованы ЯО районы, но они настолько малы, что не выявлялись использованной нами пробой к рДНК при FISH.

Локализация рДНК и ЯО районов на хромосомах Sorex araneus.

Двуцветная FISH с ПЦР теломерной пробой и пробой к 18S рДНК была проведена на хромосомах трех рас S. araneus: Cordon, Томской и Новосибирской. У всех изученных рас кластеры 18S рДНК были выявлены в терминальных районах хромосом tu и длинных плеч o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах (Рис. 8 А). Также как и на хромосомах S. granarius, блоки рДНК на хромосомах S. araneus казались частично совпадающими или прилегающими к теломерам.

Анализ профилей интенсивности теломерных и рибосомных сигналов показал, что во всех хромосомных расах пики сигналов от теломерной и рибосомной проб в значительной степени перекрывались на конце q плеч. На остальных хромосомах они перекрывались в разной степени или прилегали к теломерам.

Рис. 8. Хромосомы S. araneus расы Cordon после FISH с меченой биотином пробой к 18S рДНК (детекция авидином-FITC) (А) и после окраски AgNO3 (Б).

Районы, интенсивно красящиеся серебром, были выявлены в терминальных районах хромосом tu и длинных плеч o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах (Рис. 8 Б). Эти результаты находятся в соответствии с полученными ранее данными о числе и локализации ЯО-районов в хромосомах S. araneus из некоторых хромосомных рас (Olert, Schmid, 1978).

Таким образом, вместо 32-х ЯО районов, характеризующих кариотип S. granarius, кариотип S. araneus содержит всего 8 ЯО районов. Несмотря на терминальную локализацию, у S. araneus они локализованы в совершенно других районах хромосомных плеч, нежели у S. granarius.

Изучение структуры длинных теломер на хромосомах Sorex granarius.

То, что у S. granarius теломеры на коротких плечах акроцентриков содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора, тогда как длина TRF не превышает 100 т.п.н., свидетельствует о том, что длинные теломеры не представляют собой единый тандемный блок теломерной ДНК. Очевидно, наряду с теломерными повторами они содержат и другие повторенные последовательности. Данные о колокализации и частичном перекрывании длинных теломер с потенциальными ЯО районами позволили предположить, что этими последовательностями могут быть рибосомные повторы. Чтобы подтвердить это предположение мы сначала использовали двуцветную FISH на хромосомах и фибриллах с ПЦР теломерной пробой и микродиссекционной (МД) пробой, полученной в результате диссекции 6 копий перицентромерных районов хромосом a и b S. granarius, а затем FISH на фибриллах с теломерной PNA пробой и пробой к 18S рДНК.

Сигнал после гибридизации с МД пробой на хромосомах S. granarius был зарегистрирован в перицентромерных районах всех акроцентрических хромосом (Рис. 9 А). Однако у S. araneus сигнал был выявлен только в прицентромерных районах плеч a и b хромосом af и bc (Рис. 9 Б).

Рис. 9. FISH меченой биотином микродиссекционной пробы (детекция авидином-FITC), полученной из перицентромерных районов а и b хромосом S. granarius с хромосомами S. granarius (А) и S. araneus (Б). Окраска хромосом DAPI.

Данная проба, по-видимому, содержит в разных пропорциях теломерные, рибосомные и другие типы повторов, в том числе повторенные последовательности, специфичные для перицентромерных районов хромосомных плеч a и b. Описанное распределение сигналов свидетельствует о том, что на концах коротких плеч акроцентриков S. granarius локализованы повторяющиеся последовательности, которых в необходимом количестве для регистрации сигнала нет в терминальных районах хромосом S. araneus.

FISH с ПЦР теломерной и МД пробой на фибриллах S. granarius выявила как отрезки фибрилл, на которых сигналы от обеих проб были локализованы совместно, так и отрезки, на которых были выявлены сигналы только от микродиссекционной пробы или теломерной. В качестве контроля была проведена FISH с теми же пробами на фибриллах лабораторной мыши и S. araneus. В обоих случаях были выявлены сигналы только от теломерной пробы. Учитывая состав микродиссекционной пробы, можно предположить, что в длинных теломерах S. granarius среди теломерных повторов действительно могут быть локализованы другие типы повторенных последовательностей.

FISH, проведенная с PNA теломерной пробой и пробой к 18S рДНК на фибриллах S. granarius выявила чередование районов, окрашенных разными пробами. Кроме того, были выявлены небольшие районы, окрашенные обеими пробами (Рис. 10). Очевидно, это районы, состоящие из настолько небольших блоков теломерной и рибосомной ДНК, что они выглядят как районы, окрашенные обеими пробами. На разных фибриллах мы наблюдали сигналы разного размера и разной плотности. В ряде случаев между окрашенными участками были локализованы участки, не окрашенные ни одной из использованных проб. Причин появления неокрашенных участков может быть несколько. Не исключено, что проба к рДНК обладает недостаточной чувствительностью для выявления районов такого размера на сильно растянутых фибриллах. Следует также учитывать тот факт, что маркером ЯО районов в наших экспериментах является 18S рДНК, а ЯО районы наряду с 18S рДНК содержат еще и другие рДНК, а также спейсерные последовательности. И, наконец, мы не можем исключить, что наряду с последовательностями ЯО районов длинные теломеры S. granarius могут содержать повторенные последовательности, не имеющие отношения к ЯО районам, и «пустые» участки на окрашенных фибриллах указывают именно на них.

Рис. 10. FISH на фибриллах S. granarius с двумя пробами: меченой Cy3 PNA теломерной пробой (красный) и пробой, гомологичной 18S рДНК, меченой биотином (детекция авидином-FITC (зеленый)). Окраска фибрилл DAPI.

В аналогичных экспериментах на фибриллах S. araneus нам не удалось выявить протяженных участков, в которых бы районы, окрашенные теломерной пробой, перемежались с районами, окрашенными рибосомной пробой. Мы обнаружили лишь небольшие районы, окрашенные одной из использованных проб. Не исключено, что в тех восьми районах хромосом S. araneus, для которых нами была описана терминальная локализация ЯО, теломеры и ЯО районы перекрываются в существенно меньшей степени, чем в длинных теломерах S. granarius.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность полученных в этом исследовании данных свидетельствует о том, что S. granarius обладает необычной структурой теломерных районов хромосом, отличающейся от структуры теломер как у изученных видов млекопитающих, так и у близкородственного вида S. araneus. Их уникальность состоит в том, что теломеры на коротких плечах всех 32-х акроцентриков содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора (в среднем 213 т.п.н.), в то время как теломеры на концах метацентриков de и tu, а также на концах длинных плеч акроцентриков содержат в среднем всего 3,8 т.п.н. теломерного повтора. Поскольку у S. araneus, как мы определили с помощью модифицированной Q-FISH, теломеры составляют от 7 до 15 т.п.н., то можно предположить, что предшественник S. araneus имел размер теломер сходный с размером теломер у современных обыкновенных бурозубок, а в современном кариотипе S. granarius сформировались теломеры либо уникального, либо редко встречающегося среди млекопитающих размера.

Мы показали, что длинные теломеры S. granairus наряду с теломерными повторами содержат повторы 18S рДНК. По полученным нами данным можно представить структуру теломерных районов S. granarius следующим образом: на дистальных концах длинных теломер локализован блок тандемных теломерных повторов, за которым локализован район, в котором теломерные и рибосомные повторы перемежаются, а затем следует блок рибосомных повторов. По всей видимости, второй и третий районы могут быть разной протяженности на разных хромосомах. Поскольку второй район в длинных теломерах по своей структуре напоминает субтеломерные районы хромосом млекопитающих, которые насыщены разными повторами, перемежающимися с нативными и частично дегенерированными теломерными последовательностями (Жданова и др., 2007), то можно предположить, что формирование длинных теломер на концах хромосом S. granarius является первым шагом на пути выделения из теломер субтеломерных районов. Возможно, что формирование особой структуры теломер у этого вида было спровоцировано распадом двух метацентрических хромосом и явилось результатом глобальной реорганизации терминальных районов хромосом, сопровождающейся амплификацией и рекомбинацией теломерной и рибосомной ДНК в профазе мейоза на стадии хромосомного букета, когда терминальные районы хромосом приближены друг к другу. В пользу этого предположения свидетельствуют данные по молекулярной филогении видов из группы видов Sorex araneus, которые показывают, что в предковом кариотипе S. granarius и S. araneus могло быть не два, а четыре метацентрика: af, bc, de и tu. Два из них распались при формировании кариотипа S. granarius, но сохранились в линии S. araneus (Hausser et al., 1998).

У вида-близнеца S. araneus структура терминальных районов, по всей видимости, схожа со структурой терминальных районов общего предшественника S. araneus и S. granarius. Формирование кариотипа S. araneus сопровождалось Робертсоновскими слияниями, следствием чего явилось наличие множества рас S. araneus, чьи кариотипы отличаются числом и составом метацентриков. Мы обнаружили в перицентромерных районах метацентрических хромосом S. araneus Новосибирской расы интерстициальные теломерные последовательности. Частота выявления сигнала коррелировала с временем возникновения метацентрика. Из этого мы заключили, что Робертсоновские слияния у бурозубок могли проходить с сохранением части теломерной ДНК, которая со временем либо модифицировалась, либо терялась.

ВЫВОДЫ

1. Впервые, используя комбинированный подход, сочетающий ряд методов молекулярной цитогенетики и молекулярной биологии, была изучена структура терминальных районов хромосом у близкородственных видов бурозубок: Sorex granarius и Sorex araneus. Показано, что размер и структура теломер у Sorex granarius отличаются от таковых у вида-близнеца Sorex araneus и других изученных видов млекопитающих.

2. В хромосомах Sorex granarius было выявлено два типа теломер. Длинные теломеры размером 213 ± 5,8 т.п.н. были локализованы на коротких плечах всех 32х акроцентриков, тогда как на остальных концах хромосом были локализованы короткие теломеры (3,8 ± 0,2 т.п.н.). Длина теломерных рестрикционных фрагментов у Sorex granarius, в основном, была от 10 до 80 т.п.н.

3. Было показано, что в хромосомах Sorex araneus все теломеры близки по размеру и содержали в среднем 6,8 - 15,2 т.п.н. теломерной ДНК.

4. В перицентромерных районах хромосом Sorex araneus Новосибирской расы были выявлены интерстициальные теломерные сайты. Чем раньше в ходе кариотипической эволюции вида сформировались метацентрики, тем с меньшей частотой в них выявлялись интерстициальные теломерные сайты. По-видимому, Робертсоновские слияния у бурозубок проходили с сохранением части теломерной ДНК, которая затем постепенно либо терялась, либо модифицировалась.

5. Установлено, что на концах коротких плеч акроцентриков Sorex granarius локализованы потенциально активные ЯО районы. Наряду с теломерными повторами длинные теломеры Sorex granarius содержали 18S рибосомную ДНК.

6. У Sorex araneus потенциальные ЯО районы были выявлены в дистальных районах хромосомы tu и хромосомных плеч o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах.

7. По-видимому, формирование кариотипа Sorex granarius было связано с реорганизацией терминальных районов хромосом, сопровождающейся совместной амплификацией теломерной и рибосомной ДНК, а также негомологичной рекомбинацией хромосомных плеч.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Zhdanova N.S., Karamisheva T.V., Minina J., Astakhova N.M., Lansdorp P., Kammori M., Rubtsov N.B., Searle J.B. Unusual distribution pattern of telomeric repeats in the shrews Sorex araneus and Sorex granarius // Chromosome Res. 2005. V. 13. P. 617-625.

2. Belonogova N.M., Karamysheva T.V., Biltueva L.S., Perepelov E.A., Minina J.M., Polyakov A.V., Zhdanova N.S., Rubtsov N.B., Searle J.B., Borodin P.M. Identification of all pachytene bivalents in the common shrew using DAPI-staining of synaptonemal complex spreads // Chromosome Res. 2006. V. 14. P. 673-679.

3. Zhdanova N.S., Minina J., Karamisheva T.V., Draskovic I., Rubtsov N.B., Londono-Vallejo J. The very long telomeres in Sorex granarius (Soricidae, Eulipotyphla) contain ribosomal DNA // Chromosome Res. 2007. V. 15. P. 881-890.

4. Minina J.M., Borodin P.M., Searle J.B., Volobouev V.T., Zhdanova N.S. Standard DAPI karyotype of the common shrew Sorex araneus L. (Soricidae, Eulipotyphla) // Russian J. of Teriology. 2007. V. 6. P. 3-6.

5. Zhdanova N.S., Minina J., Karamisheva T.V., Rubtsov N.B. Distribution of telomeric and ribosomal DNA in chromosomes of two related species, Sorex araneus and Sorex granarius (Soricidae, Eulipotyphla) // Russian J. of Teriology. 2007. V. 6. P. 7-13.

6. Жданова Н.С., Рубцов Н.Б., Минина Ю.М. Терминальные районы хромосом млекопитающих: эволюционный аспект (обзор) // Генетика. 2007. T. 42. C. 721-732.

7. Zhdanova N., Karamisheva T., Astakhova N., Rubtsov N., Minina J., Landsdorp P., Kammori M. Localization of telomere repeats in chromosomes of two species, Sorex araneus and Sorex granarius // Chromosome Res. 2004. V. 12. P. 60-61.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»