WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

de, tu, a, b, c, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r

36 / 37

S. araneus, Cordon

de, tu, af, bc, jl, g, h, i, k, m, n, o, p, q, r

30 / 31

S. araneus, Томская

de, tu, af, bc, jl, gk, hi, mn, o, p, q, r

24 / 25

S. araneus, Новосибирская

de, tu, af, bc, jl, ik, go, hn, mp, qr

20 / 21

Рис. 1. А - кариотип S. granarius, 2n=36, XX; Б - кариотип S. araneus Новосибирской расы, 2n=21, XY1Y2; окраска хромосом DAPI. Изображения инвертированные.

Рис. 2. Идиограмма окрашенных DAPI хромосом S. araneus Новосибирской расы. Изображение инвертированное.

Локализация теломерной ДНК и размер теломер на хромосомах Sorex granarius.

FISH с теломерной пробой, синтезированной в ПЦР, выявила теломерные сигналы только в терминальных районах коротких плеч всех акроцентриков S. granarius (Рис. 3 А). Выявить все теломеры на хромосомах S. granarius удалось при проведении Q-FISH с PNA теломерной пробой (Рис. 3 Б). Оказалось, что теломеры, локализованные на коротких плечах 32-х акроцентриков, содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора (в среднем 213 ± 5,8 т.п.н.), тогда как теломеры, локализованные на длинных плечах акроцентриков и на метацентрических хромосомах de и tu, содержат в среднем 3,8 ± 0,2 т.п.н. Таких длинных и таких коротких теломер до сих пор не было описано ни у одного изученного вида млекопитающих. Таким образом, теломеры на хромосомах S. granarius разделяются на 2 типа: длинные и короткие. Интерстициальной теломерной ДНК в хромосомах этого вида выявлено не было.

Рис. 3. FISH на хромосомах S. granarius: А - меченой биотином ПЦР теломерной ДНКпробы (детекция авидином-FITC); Б –меченой Cy3 теломерной PNA пробы. Окраска хромосом DAPI.

Другой удивительный факт связан с тем, что длинные теломеры локализованы на коротких плечах акроцентриков, а короткие - на длинных (Zhdanova et. al., 2005). Полиморфизм по размеру теломер на р и q плечах хромосом у млекопитающих был ранее описан, однако у всех изученных видов теломеры на коротких плечах были существенно короче, чем на длинных (McElligott et al., 1997; Slijepcevic, 2001; Modino et al., 2002).

Дополнительно размер теломер в хромосомах S. granarius был определен с помощью TRF (терминальные рестрикционные фрагменты) анализа. Длина рестрикционных фрагментов варьировала, в основном, от 10 до 80 т.п.н. и не превышала 100 т.п.н. (Рис. 4). Поскольку с помощью Q-FISH было показано, что длинные теломеры содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора, то полученные данные указывают на то, что эти теломеры наряду с теломерной ДНК должны содержать другую ДНК, в которой локализованы сайты рестрикции для RsaI или HinfI.

Рис. 4. Результат блот-гибридизации по Саузерну высокомолекулярной геномной ДНК S. granarius, обработанной RsaI и HinfI, с меченым P32 олигонуклеотидом (СССТАА)5 (справа). Слева – линейка ДНК фрагментов в т.п.н.

Локализация теломерной ДНК и размер теломер на хромосомах Sorex araneus.

В отличие от S. granarius сигналы визуально одной интенсивности после FISH с ПЦР пробой к теломерным повторам были выявлены на концах всех хромосом S. araneus из всех изученных хромосомных рас (Рис. 5).

Рис. 5. FISH меченой биотином ПЦР пробы к теломерным последовательностям на хромосомах S. araneus расы Cordon (А), Томской (Б) и Новосибирской расы (В). Детекция сигнала авидином-FITC. Окраска хромосом DAPI.

На хромосомах Новосибирской расы был проведен анализ сигналов в интерстициальных сайтах (ITS). Из данных таблицы 2 видно, что с наибольшей частотой (от 29% до 81%) ITS были выявлены в перицентромерных районах хромосом: ik, go, jl, hn, mp и qr. В перицентромерных районах хромосом bc, af, de и tu частоты сигналов были существенно ниже и не превышали 10%. Кроме того, ITS с частотами 19% и 12% были выявлены в плече а хромосомы af и в плече b хромосомы bc, соответственно. Проще всего полученные данные объяснить, если предположить, что Rb слияния у бурозубок проходили с сохранением, по крайней мере, части теломерной ДНК, которая впоследствии как нефункциональная проявляла тенденцию к потере или модификации.

Таблица 2. Частоты встречаемости ITS после FISH с ПЦР теломерной пробой на хромосомах S. araneus Новосибирской расы.

Хромосома

af

bc

ik

go

jl

hn

mp

qr

tu

de

Частота встречаемости ITS в % на хромосоме

2

9

50

44

29

46

81

74

7

7

Проанализировано 104 метафазные пластинки.

Размер теломер в хромосомах S. araneus Томской и Cordon рас был определен с помощью модифицированной QFISH. В качестве стандарта были использованы длинные и короткие теломеры S. granarius, размер которых был ранее определен с помощью стандартной QFISH (Zhdanova et al., 2005). Данные по измерению интенсивностей свечения теломерных сигналов приведены в таблице 3.

Отношения средней интенсивности свечения сигналов на длинных и коротких теломерах S. granarius к средней интенсивности свечения сигналов на теломерах S. araneus Cordon расы оказались равными 31,3 (z = 27,62; p<0,001) и 0,42 (z = 19,5 p<0,001) соответственно. Учитывая данные по длине теломер у S. granarius (213 и 3,8 т.п.н. (Zhdanova et al., 2005)), можно легко подсчитать размер теломер у S. araneus Cordon расы. Он составляет 6,8 – 9 т.п.н. Аналогичный подсчет показал, что на хромосомах S. araneus Томской расы размер теломер составляет 11,5 – 15,2 т.п.н., а соответствующие отношения - 18,5 (z = 27,05; p<0,001) и 0,25 (z = 27,01; p<0,001). Следует заметить, что если распределение интенсивностей свечения для теломер S. granarius, особенно для длинных теломер, приближалось к нормальному, то распределение интенсивностей свечения для теломер S. araneus резко отличалось от нормального и указывало на то, что у S. araneus наряду с теломерами размером 15 т.п.н. встречались теломеры, содержащие существенно большее количество теломерной ДНК. Однако мы особо обращаем внимание на то, что в обеих хромосомных расах S. araneus размер теломер на коротких плечах акроцентриков с одной стороны и длинных плечах акроцентриков и на метацентриках с другой стороны достоверно не различался.

Таким образом, теломеры S. araneus оказались близки по размеру к описанным ранее теломерам диких видов млекопитающих, а особые размеры теломер, установленные нами для хромосом S. granarius, характерны только для этого вида бурозубок.

Таблица 3. Средние интенсивности свечения теломерных сигналов в хромосомах S. granarius и S. araneus Cordon и Томской рас.

Вид

Sorex granarius

Sorex araneus

раса

Cordon

Томская

теломеры

На коротких плечах акроцентриков

На метацентриках и длинных плечах акроцентриков

На концах всех хромосом

На коротких плечах акроцентриков

На длинных плечах акроцентриков

На концах всех хромосом

На коротких плечах акроцентриков

На длинных плечах акроцентриков

средняя интенсивность теломерного сигнала за вычетом фона

344551±5895

4657±140

11006±282

10799±435

9706±355

18583±489

12066±668

13416±675

Локализация 18S рДНК на метафазных хромосомах и в интерфазных ядрах Sorex granarius.

Двуцветная FISH с ПЦР теломерной пробой и пробой к 18S рДНК выявила кластеры рибосомной ДНК на концах коротких плеч всех 32-х акроцентриков S. granarius (Рис. 6 А). Однако интенсивность сигналов от пробы к рДНК на разных акроцентриках была разной. На акроцентриках o, p, q и r интенсивность сигналов была настолько мала, что блоки рДНК выявлялись не во всех экспериментах. Локализация сигналов от проб к теломерной и 18S рДНК визуально совпадала. Чтобы более точно определить, как относительно друг друга расположены блоки теломерной и рДНК на коротких плечах акроцентриков, мы проанализировали профили интенсивностей гибридизационных сигналов от этих проб как минимум для 20 копий каждого из акроцентриков. Оказалось, что сигналы от проб к теломерной и рДНК на разных акроцентриках перекрывались в разной степени. На некоторых акроцентриках пики сигналов проб к теломерной и рДНК практически совпадали, как, например, на акроцентрике m (Рис. 6 Б). Были выявлены также акроцентрики, например, акроцентрик i, на котором блок рДНК прилегал к теломере (Рис. 6 В).

Рис. 6. А - FISH меченой биотином пробы к 18S рДНК (детекция авидином-FITC (зеленый)) на хромосомах S. granarius. Окраска хромосом DAPI. Типичные профили распределения интенсивности трех сигналов по хромосоме m (Б) и i (В): теломерного (1), 18S рибосомного (2) и DAPI (3).

Сходные результаты были получены на интерфазных ядрах после двуцветной 3D-FISH с ПЦР теломерной пробой и пробой к 18S рДНК на препаратах, обработанных и не обработанных РНК-азой А (Zhdanova et al., 2007). На препаратах, не обработанных РНК-азой А в интерфазных ядрах выявлялись крупные блоки теломерной ДНК, большая часть из которых имела контакт с ядрышками. На препаратах, обработанных РНКазой А, двуцветная 3D-FISH выявила в ядрах S. granarius колокализацию или частичное перекрывание сигналов, соответствующих теломерной и рДНК (Рис. 7 А). Таким образом, мы можем говорить о полной или частичной колокализации потенциальных ЯО районов не только на метафазных хромосомах, но и в интерфазных ядрах S. granarius.

Выявление активных ЯО районов на хромосомах Sorex granarius.

Показано, что активные ЯО районы представляют собой Ag+ бэнды (Verma, Babu 1995). Мы выявили такие бэнды на концах коротких плеч всех акроцентриков S. granarius. Кроме того, дополнительно красящиеся серебром районы часто выявлялись в перицентромерном районе хромосомы de, а также в дистальных и перицентромерном районах хромосомы tu (Рис. 7 Б).

Рис. 7. А - Оптический срез (0,6 мкм) интерфазного ядра Sorex granarius после FISH с биотинилированной пробой к теломерной (детекция авидином-FITC (зеленый)) и к 18S рДНК, меченой дигоксигенином (детекция антидигоксигенином-Cy3 (красный)). Б - Хромосомы S. granarius, окрашенные AgNO3. Стрелки указывают на дополнительные Ag+ бэнды.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»