WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

МИНИНА ЮЛИЯ МИХАЙЛОВНА

ТЕРМИНАЛЬНЫЕ РАЙОНЫ ХРОМОСОМ У ДВУХ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ БУРОЗУБОК, Sorex granarius

И Sorex araneus (SORICIDAE, EULIPOTYPHLA)

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2008

Работа выполнена в Лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Жданова Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Высоцкая Людмила Васильевна

кандидат биологических наук,

Лебедев Игорь Николаевич

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный

университет, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится 30 апреля 2008 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «____» марта 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Терминальные районы представляют собой хромосомные домены, которым отводится главенствующая роль в сохранении стабильности хромосом и определяющая роль в эволюции генома. Согласно современным представлениям, терминальные районы хромосом состоят из теломер и прилегающих к ним субтеломерных районов, отделяющих теломеру от основного тела хромосомы.

Теломеры состоят из тандемных (ТТАГГГ)n повтров и заканчиваются Г-обогащенным одноцепочечным концом, который «кэппирует» конец теломеры. Важную роль в поддержании структуры теломер играют белковые факторы TRF1/TRF2, осуществляющие регуляцию длины теломер, а также ряд факторов, необходимых для функционирования теломер и участвующих в репарации и рекомбинации ДНК (Saldanha et al., 2003). Теломеры играют важную роль в правильном протекании мейоза, а также во многих ключевых клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, клеточное старение и онкотрансформацию (Blasco et al., 1999; Feuerbach et al., 2002). Во многом они определяют структуру интерфазного ядра (Nagele et al., 2001).

Репликация теломер осуществляется с помощью специального фермента, теломеразы, представляющего собой комплекс обратной транскриптазы и РНК матрицы. Уменьшение активности теломеразы в соматических клетках человека приводит к нарушению структуры теломер и хромосомной нестабильности (Shay, Bacchetti, 1997; Gisselson et al., 2001). В настоящее время описан альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации теломерных и субтеломерных последовательностей (Bhattacharyya, Lustig, 2006; Bryan, Reddel, 1997), с помощью которого клетки преодолевают ростовой кризис в отсутствии теломеразы и становятся «бессмертными».

Субтеломерные районы хромосом также содержат повторенные последовательности, но это, как правило, смесь разного рода повторенных последовательностей и сегментных дупликаций. Субтеломеры являются наиболее пластичными хромосомными районами, для которых характерна повышенная частота рекомбинационных и мутационных событий. Эти свойства субтеломер обуславливают их роль в молекулярной эволюции генома и этиологии ряда врожденных заболеваний человека (Linardopoulou et al., 2005; Flint et al., 1995).

Несмотря на то, что теломеры и субтеломеры играют важную роль в структурно-функциональной организации хромосом, структура этих районов практически не изучена у других видов млекопитающих, нежели человек и мышь. Тем не менее, даже эти немногочисленные данные указывают на то, что структура этих районов может быть очень разной даже у близкородственных видов. В данном исследовании была изучена структура терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок: бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus) (Soricidae, Eulipotyphla). Кариотипы этих видов составлены из одинаковых на цитологическом уровне хромосомных плеч, однако отличаются числом акроцентрических и метацентрических хромосом. Главенствующую роль в их кариотипической эволюции сыграли Робертсоновские (Rb) перестройки, обусловленные слиянием акроцентриков и распадом метацентрических хромосом. Принимая во внимание тот факт, что эти виды-близнецы дивергировали недавно, несколько сот тысяч лет тому назад (Taberlet et al., 1994), мы надеялись выявить следы недавних эволюционных преобразований, связанных с терминальными районами хромосом.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок: бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus), представленной в нашем исследовании тремя хромосомными расами, которые отличаются интенсивностью Робертсоновских слияний, а также определение локализации теломерных последовательностей в хромосомах этих видов.

Непосредственные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Адаптировать дифференциальную окраску DAPI для идентификации всех хромосом S. granarius и S. araneus при проведении FISH с используемыми в исследовании пробами;

2. Используя FISH, изучить распределение теломерных последовательностей в хромосомах S. granarius и S. araneus и оценить размер теломер в хромосомах этих видов с помощью разных методических подходов: Q-FISH, модифицированной Q-FISH и TRF анализа;

3. Определить локализацию рибосомной ДНК и потенциально активных ядрышкообразующих районов на хромосомах S. granarius и S. araneus;

4. Изучить структуру теломер S. granarius, используя двуцветный FISH на фибриллах с теломерной и микродиссекционной пробой, полученной из перицентромерных районов двух акроцентриков S. granarius, а также с PNA теломерной пробой и пробой к 18S рДНК.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые было изучено распределение теломерной ДНК и определены размеры теломер в хромосомах S. granarius и S. araneus. У S. granarius выявлены теломеры двух типов: очень длинные, содержащие в среднем 213 т.п.н., и очень короткие, содержащие в среднем 3,8 т.п.н. теломерного повтора. Размер теломер в разных хромосомных расах близкородственного вида S. araneus колебался от 6,8 до 15,2 т.п.н.

2. Впервые в хромосомах S. araneus Новосибирской расы были выявлены ITS, причем частота встречаемости их в перицентромерных районах была тем выше, чем позже в ходе кариотипической эволюции эти хромосомы сформировались.

3. Впервые было показано, что число и локализация потенциально активных ядрышкообразующих районов может сильно различаться у видов-близнецов. У S. granarius ЯО районы были локализованы на концах коротких плеч 32-х акроцентриков, тогда как у S. araneus ЯО районы были локализованы в дистальных районах плеч t, u, o и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах.

4. Впервые у одного из видов бурозубок, S. granarius, были описаны теломеры, необычной для млекопитающих структуры, в которых теломерные последовательности перемежаются с рибосомными.

Полученные в ходе исследования результаты используются при чтении спецкурса «Цитогенетика» для студентов 4го курса специальности «цитология и генетика» биологического отделения ФЕН Новосибирского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту.

1. Использование подхода, сочетающего ряд методов молекулярной цитогенетики: FISH с набором проб разного происхождения на хромосомах и отдельных фибриллах, Q-FISH в классическом и модифицированном вариантах, 3D-микроскопии, выявление потенциально активных ЯО районов с помощью окраски серебром, а также определение размеров рестрикционных теломерных фрагментов позволило установить, что размер и структура теломер у S. granarius отличаются от таковых у вида-близнеца S. araneus и других изученных видов млекопитающих.

2. У S. granarius выявлено два типа теломер: теломеры первого типа локализованы на коротких плечах 32-х акроцентриков и содержат в среднем 213 т.п.н. теломерной ДНК. В проксимальной части большинства этих теломер теломерные повторы перемежаются с рибосомными. Второй тип представлен короткими теломерами размером 3,8 т.п.н. Они локализованы на остальных концах хромосом. Таким образом, теломеры в одной клетке и даже на одной хромосоме S. granarius могут различаться по размеру почти на два порядка.

3. По-видимому, теломеры уникальной структуры на хромосомах S. granarius сформировались в результате реорганизации терминальных районов хромосом, заключающейся в совместной амплификации теломерных и рибосомных повторов и перераспределении их по терминальным районам хромосом.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на «The Chromosome Conference XV» (Лондон, Великобритания, 2004), на «7th Meeting of the International Sorex araneus Cytogenetic Committee (ISACC)» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), на «17th European Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene Mapping» (Лисcабон, Португалия, 2006), на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, Россия, 2007), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 21 рисунком и содержит 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы фибробласты S. granarius и S. araneus Томской, Новосибирской и Cordon рас на 2-10 пассажах культивирования. Культуры первичных фибробластов получали из фрагментов межрёберных мышц. Препараты метафазных хромосом делали по стандартной методике с гипотонической обработкой 0.074 M р-ом KCl при 370С в течение 25-30 мин. Для приготовления препаратов фибрилл на предметные стекла наносили 2 мкл суспензии клеток в PBS. Ядра лизировали в 10 мкл буфера STE1 (0,5% SDS, 50 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис, pH 7.0), наклоняя стекла под углом 450 (Parra, Windle, 1993). ЯО районы выявляли с помощью 50% р -ра AgNO3 в 2%-ном р -ре желатина, инкубируя препараты 3-7 мин. при 600С (Verma, Babu, 1995). Теломерные последовательности выявляли с помощью меченых био-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ проб, полученных с помощью ПЦР в безматричном синтезе с олигонуклеотидами (TTAGGG)5 и (CCCTAA)5 (Ijdo et al, 1991). Для проведения Q-FISH и модифицированной Q-FISH использовали меченую Cy3 PNA пробу (CCCTAA)3 (Applied Biosystems). Рибосомные повторы выявляли с помощью фрагмента 18S рДНК человека размером 3,2 т.п.н., клонированного в плазмиде pHr13 (Малыгин и др, 1992) и меченого био-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ в ник-трансляции (набор реактивов ООО "Медиген"). Микродиссекцию хромосомных районов и мечение микробиблиотек в DOP-ПЦР проводили по протоколу Рубцова и других (Rubtsov et al., 2000). FISH и двуцветную FISH на хромосомах и фибриллах проводили по стандартному протоколу с рядом модификаций (Zhdanova et. al., 2005). 3D-FISH на интерфазных ядрах, специально приготовленных для трехмерной микроскопии, проводили так, как описано у Соловей с соавторами (Solovei et al, 2002). Для TRF анализа теломерной ДНК использовали высокомолекулярную ДНК (Blocher, Kunhi, 1990). TRF анализ был проведен Ж.-А. Лондоно-Валехо (Франция) (Londono-Vallejo et al., 2001). Q-FISH с PNA пробой была проведена на приготовленных нами препаратах хромосом S. granarius П. Лансдорпом (Канада) (Lansdorp et al., 1996; Zijlmans et al., 1997), а модифицированная Q-FISH была проведена нами так, как описано у Вонга и Слижепцевика (Wong, Slijepcevic, 2004). Для статистической обработки данных модифицированной Q-FISH использовали пакет программ STATISTICA 6 (StatSoft Inc., USA, http://www.statsoft.com/downloads/maintenance/download6.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кариотипы Sorex granarius и Sorex araneus: дифференциальная

окраска хромосом DAPI.

S. granarius и S. araneus относятся к группе видов Sorex araneus, для которых характерно определение пола XX/XY1Y2 (Pack et al., 1993). Единицей кариотипов S. granarius и S. araneus являются хромосомные плечи, обозначаемые буквами латинского алфавита. Робертсоновские перестройки играли ведущую роль в формировании кариотипов этих видов. В настоящее время предпочтение отдается гипотезе, согласно которой предковый кариотип S. granarius и S. araneus содержал как минимум четыре метацентрика: af, bc, de и tu (Taberlet et al., 1994; Fumagalli et al., 1996). Два из них распались у S. granarius, но сохранились у S. araneus. Во всех хромосомных расах S. araneus наряду с упомянутыми выше метацентриками присутствует хромосома jl, а остальные хромосомные плечи представлены либо акроцентриками, либо формируют метацентрики в разных сочетаниях в отдельных расах. В таблице 1 приведены кариотипы использованных в работе видов и рас бурозубок. Кариотипы S. granarius и S. araneus представлены на рисунке 1.

Идентификация хромосом S. granarius и S. araneus обычно проводилась согласно идиограмме G-дифференциально окрашенных хромосом. Поскольку в работе стояла задача идентифицировать хромосомы этих видов в FISH экспериментах, то мы составили идиограмму окрашенных DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндол) хромосом (Рис. 2) и показали, что характер дифференциальной исчерченности после окраски DAPI и Гимза после предобработки трипсином оказался схож (Minina et al., 2007).

Таблица 1. Описание кариотипов S. granarius и S. araneus (по Wojcik et al., 2003).

Вид, раса

Кариотип самки

2n у самки/самца

S. granarius

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»