WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 клетками тимуса интактных животных. При исследовании экспрессии мРНК VEGF и TSP-1 в цельном тимусе мышей была выявлена экспрессия мРНК обоих факторов (Табл. 1). В дальнейших исследованиях мы разделили клетки тимуса на тимоциты и строму тимуса и исследовали экспрессию мРНК ангиорегуляторных факторов отдельно. Нами было показано, что как стромальные клетки тимуса, так и сами тимоциты экспрессируют мРНК VEGF и TSP-1. Строма тимуса представлена различными типами клеток, эндотелиоцитами, фибробластами, макрофагами, дендритными клетками и эпителиальными клетками стромы. Известно, что все они способны синтезировать VEGF и TSP-1 (Polverini, 1997; Dikov et al., 2005; Wang et al., 2002; Inoue et al., 2001, Muller et al., 2005). Синтез VEGF и TSP-1 тимоцитами показан нами впервые.

Для изучения механизмов влияния VEGF на клетки тимуса необходимо было показать присутствие на них рецепторов VEGF. С помощью ОТ-ПЦР, в пределах чувствительности данного метода, было установлено, что изолированные тимоциты экспрессируют мРНК VEGFR2 и не экспрессируют мРНК VEGFR1. При этом клетки стромы тимуса синтезировали мРНК обоих рецепторов, что может объясняться наличием в ней сосудов. Различия в экспрессии генов рецепторов между стромой тимуса и тимоцитами подтверждают правомочность применения нами методического подхода с разделением клеток тимуса на две части. Способность тимоцитов экспрессировать мРНК VEGFR2 показана нами впервые. Периферические лимфоциты, выделенные из паховых лимфоузлов, также как и тимоциты, синтезировали мРНК VEGF, TSP-1 и VEGFR2, но не VEGFR1 (Табл. 1).

Таблица 1 Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 клетками тимуса и лимфоцитами интактных мышей.

Синтез мРНК

VEGF

VEGFR1

VEGFR2

TSP-1

Тимус цельный

+

+

+

+

Тимоциты

+

-

+

+

Строма тимуса

+

+

+

+

Лимфоциты

лимфоузлов

+

-

+

+

Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 в тимусе мышей в динамике роста гепатомы. При росте гепатомы синтез VEGF в тимоцитах не усиливался. Напротив, исследование экспрессии мРНК VEGF в тимоцитах на 7 сутки роста гепатомы выявило снижение этого показателя; на других сроках исследования отличий от контроля не было.

При этом, в строме тимуса было обнаружено усиление экспрессии мРНК ангиогенной молекулы на 7, 21 и 28 сутки роста гепатомы по сравнению с контролем (Рис. 1).

При исследовании влияния роста гепатомы на синтез мРНК другого фактора- TSP-1 было установлено, что экспрессия его мРНК достоверно усиливается на 21 и 28 сутки в тимоцитах и не изменяется в строме тимуса (Рис. 2а). На 7, 21 и 28 сутки роста опухоли наблюдалось усиление экспрессии мРНК VEGFR2 в тимоцитах мышей- опухоленосителей по сравнению с тимоцитами, полученными от контрольной группы животных (Рис. 2б). При этом, усиление экспрессии мРНК VEGFR2 тимоцитами происходило одновременно с усилением синтеза мРНК VEGF в строме тимуса, что было отмечено нами на 7, 21 и 28 сутки роста опухоли. Экспрессия мРНК другого рецептора – VEGFR1 в тимоцитах мышей не была обнаружена в процессе опухолевого роста, так же как и у интактных животных.

В строме тимуса, параллельно с усилением синтеза мРНК VEGF, было выявлено усиление экспрессии мРНК VEGFR2. Этот показатель достоверно увеличивался на ранних сроках роста опухоли (3 и 7 сутки) по сравнению с теми же показателями у контрольной группы животных.

Исследование синтеза белка VEGFR2 в тимусе с помощью вестерн-блота выявило, что тимоциты и стромальные клетки тимуса интактных животных синтезируют VEGFR2 (Рис. 3). В положительном контроле (ткани печени) и строме тимуса детектировалась продукция двух форм рецептора с молекулярной массой 190 кДа и 230 кДа (Рис. 3а), в то время как в тимоцитах была обнаружена только одна форма рецептора 190 кДа (Рис. 3б). Однако, не смотря на то, что мы показали усиление экспресии мРНК VEGFR2 в тимоцитах, нам не удалось выявить различий в синтезе белка VEGFR2 между тимоцитами, полученными от опухолевых животных на 21 сутки роста экспериментальной гепатомы и тимоцитами контрольной группы мышей.

Рис. 2 Влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитамх. А- экспрессия мРНК TSP-1; Б- экспрессия мРНК VEGFR2

По оси абсцисс- время после инокуляции опухолевых клеток, сутки (n=8; в контроле (К) n=40). По оси ординат- экспрессия мРНК в условных единицах; результаты нормализованы относительно -актина. На рисунке представлены (М±).

* - различия с контролем по критерию Вилкоксона достоверны при р<0,05; ** - при р< 0,01.

Сопоставление полученных данных по синтезу мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 в тимусе мышей с инволюцией железы при опухолевом росте и уровнем содержания VEGF в циркуляции. Поскольку при длительном перевивании и хранении опухолевые клетки могут менять свои свойства, нами была подтверждена, описанная ранее, способность гепатомы 22а вызывать инволюцию тимуса. При исследовании изменения массы и клеточности тимуса в динамике роста гепатомы 22а эти показатели снижались, начиная с 3-й недели роста опухоли, и к 35 суткам составляли около 20% от показателей контрольных животных.

Рис. 3 Влияние опухолевого роста на синтез белка VEGFR2 клетками тимуса (Вестерн- блот).

М- маркер молекулярного веса, 1- ткань печени, 2- строма (А) или тимоциты (Б) контрольных животных, 3- строма (А) или тимоциты (Б) мышей на 21 сутки роста гепатомы.

При исследовании сывороточных концентраций VEGF при росте гепатомы было показано, что данный показатель не меняется ни на одном из сроков исследования (3, 7, 14, 21, 28 и 35 сутки роста опухоли) и не отличается от такового у контрольных животных. Однако, при этом, в экспериментах in vitro с помощью метода ОТ-ПЦР нами было показано, что гепатома способна синтезировать мРНК VEGF и секретировать его в культуральную среду (концентрация VEGF164 в супернатанте 48ч культуры гепатомы составляла 200 пг/мл). Возможно, отсутствие повышения уровня содержания VEGF в циркуляции связано с тем, что VEGF связывается с матриксом и в циркуляцию не попадает. Таким образом, развитие инволюции тимуса при росте гепатомы не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в сыворотке крови. Однако при этом мы наблюдали усиление синтеза мРНК VEGF в строме тимуса.

При сопоставлении данных ОТ-ПЦР с динамикой морфологических изменений в тимусе оказалось, что изменения экспрессии некоторых генов начинались в тимусе уже на 3 сутки после инокуляции гепатомы, т.е. за долго до появления количественных изменений массы и клеточности тимуса. К таким показателям относятся: усиление экспрессии мРНК VEGFR2 в строме тимуса на 3 сутки, а так же увеличение экспрессии мРНК VEGFR2 тимоцитами и VEGF стромальными клетками тимуса на 7 сутки роста гепатомы (Табл. 2). На более поздних этапах роста опухоли (21 и 28 сутки) снижение массы и клеточности вилочковой железы у экспериментальных животных сопровождалось усилением экспрессии мРНК VEGF в строме, а также усилением экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Ранее было показано, что начиная с 21 суток роста гепатомы в тимусе наблюдаются гистологические изменения, выражающиеся в прогрессирующем истончении корковой зоны, уменьшении плотности малых лимфоцитов и снижении количества больших лимфоцитов (Киселева, 2002).

Таблица 2. Синтез мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 в тимусе мышей в динамике роста опухоли.

Сутки

Изолированные тимоциты

Строма тимуса

VEGF

TSP-1

VEGFR2

VEGF

TSP-1

VEGFR1

VEGFR2

3

=

=

=

=

=

=

7

=

=

14

=

=

=

=

=

=

=

21

=

=

=

=

28

=

=

=

=

Примечания: увеличение уровня экспрессии мРНК по отношению к контролю,

снижение показателя, = отсутствие изменений в уровне экспрессии мРНК.

Таким образом, усиление локального синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе предшествовало появлению морфологических изменений в этом органе и может скорее рассматриваться как причина инволюции тимуса, чем её следствие.

Исследование влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 перитонеальными макрофагами мышей. Следующим этапом наших исследований явилось изучение экспрессии мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 в динамике роста экспериментальной гепатомы другими, удаленными от опухолевого узла клетками, а именно, перитонеальными макрофагами мышей. В предварительных экспериментах нами было показано, что макрофаги интактных мышей конститутивно экспрессируют мРНК VEGF, его рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 и TSP-1, что соответствует данным литературы (Jaffe et al., 1985; McLaren et al., 1996). При исследовании влияния роста опухоли на те же показатели, было установлено, что уровень экспрессии мРНК VEGF и VEGFR1 не изменяется, при этом, на поздних сроках роста гепатомы (35 сутки) в макрофагах увеличивается уровень экспрессии мРНК VEGFR2 (Рис. 4а). Кроме того, на 28 и 35 сут роста гепатомы, было показано усиление экспрессии мРНК TSP-1 (Рис. 4б).

Рис. 4 Влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGFR2 и TSP-1 перитонеальными макрофагами мышей. А- экспрессия мРНК VEGFR2 Б- экспрессия мРНК TSP-1. По оси абсцисс - время после инокуляции опухолевых клеток, сутки (n=8; в контроле (К) n=40). По оси ординат - экспрессия мРНК в условных единицах; результаты нормализованы относительно -актина. На рисунке представлены (М±).

* - различия с контролем по критерию Вилкоксона достоверны при р<0,05; ** - при р< 0,01.

При сопоставлении полученных данных по изменению экспрессии мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 в перитонеальных макрофагах мышей и тимусе было выявлено однонаправленное изменение двух из четырех показателей, а именно: усиление экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 на поздних сроках опухолевого роста.

Для того, чтобы выяснить, в какой мере эти изменения могут быть вызваны усилением локального синтеза VEGF в тканях, мы исследовали эффекты VEGF на синтез макрофагами мРНК ангиорегуляторных молекул VEGF и TSP-1, а так же рецепторов VEGF in vitro. Можно предположить, что уровень содержания VEGF в перитонеальной полости может повышаться за счет его синтеза клетками серозного эпителия или другими клетками.

Исследование влияния VEGF на экспрессию мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 перитонеальными макрофагами мышей in vitro. При исследовании влияния VEGF на перитонеальные макрофаги in vitro нами было установлено, что инкубация макрофагов в присутствии этого фактора в течение 24 часов вызывает усиление синтеза мРНК самого VEGF и его рецепторов - VEGFR1 и VEGFR2 (Табл. 3).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»