WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

КРЫЛОВ

Андрей Витальевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ И ТРОМБОСПОНДИНА-1 В КЛЕТКАХ ТИМУСА И ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГАХ МЫШЕЙ ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

14.00.36 АЛЛЕРГОЛОГИЯ ИИММУНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2008

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель доктор медицинских наук Киселева Екатерина Прохоровна.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна

Доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

Ведущая организация Институт цитологии РАН

Защита состоится «….» ……………..2008 года в «……» часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. акад.И.П.Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан «……» ………………..2008 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

Актуальность проблемы. Клетки иммунной системы являются основным эффекторным механизмом, обеспечивающим антигенный гомеостаз организма. Считается, что иммунный надзор осуществляет контроль за появлением трансформированных клеток в организме. Однако, этот контроль не является достаточно эффективным вследствие развития иммунодепрессивных состояний, сопровождающих рост большинства опухолей. Хотя механизм, с помощью которого опухоли избегают иммунного надзора не вполне ясен, многие связывают его развитие с выделением различных иммуносупрессорных факторов, как самими опухолевыми клетками, так и нормальными клетками организма. В последнее время появились данные о том, что к таким факторам можно также отнести и ангиорегуляторные молекулы, такие как ростовой фактор эндотелия сосудов (VEGF) и белок внеклеточного матрикса тромбоспондин-1 (TSP-1). VEGF играет важную роль в инициации неоангиогенеза и является необходимым компонентом опухолевой прогрессии, в то время как TSP-1 является антиангиогенным фактором, оказывающим подавляющее влияние на рост клеток эндотелия в различных моделях.

Показано, что VEGF может оказывать ряд иммуносупрессорных эффектов, в частности вызывать развитие инволюции тимуса (Ohm et al., 2003). Инволюция тимуса сопровождает развитие многих опухолей человека и животных и может создавать основу для развития Т-клеточного иммунодифицита в организме. Изучение механизмов этого процесса является актуальным, поскольку разработка методов, препятствующих этому процессу, могла бы существенно увеличить продолжительность жизни онкологических больных. Одним из возможных механизмов действия VEGF является усиление апоптоза тимоцитов (Киселева, 2002). TSP-1 способен оказывать подавляющее действие на периферические Т-лимфоциты (Doyen et al., 2003), а также вызывать в них апоптоз (Manna, Frazier, 2003).

Многие опухолевые клетки продуцируют оба этих фактора (Lawler 2002; Senger et al., 1986). Известно, что сывороточные концентрации VEGF при росте опухолей могут увеличиваться (Kondo et al., 1994), а уровень содержания TSP-1 может значительно варьировать и быть как пониженным, так и повышенным (Tuszynski, Nicosia, 1996). Накопление VEGF и TSP-1 в циркуляции может оказывать системный эффект и подавлять нормальное функционирование иммунной системы.

Многие нормальные клетки организма и, в частности, клетки иммунной системы также способны синтезировать VEGF и TSP-1, что показано in vitro (Carpizo, Iruela-Arispe, 2000; Bottomley M.J. et.al., 1999). Мы предположили, что усиление внутриорганного синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе может влиять на развитие Т-клеточного иммунодефицита при опухолевом росте. Поскольку хорошо известно, что активными продуцентами VEGF и TSP-1 и основными регуляторами ангиогенеза в организме являются макрофаги, мы проводили сравнительное изучение системного влияния опухолевого роста на тимус и перитонеальные макрофаги.

Перспективность исследования связана с возрастающим интересом клиницистов к применению антиангиогенных препаратов для лечения новообразований. В качестве мишеней для создания таких препаратов широко используются молекулы VEGF и TSР-1, причем без учета их иммуномодулирующих эффектов. Поэтому изучение синтеза VEGF и TSP-1 клетками иммунной системы является актуальной задачей исследования.

Цель работы. Оценка локального синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе и перитонеальных макрофагах мышей при росте сингенной опухоли гепатома 22а.

Для этого решались следующие задачи:

  1. Оценить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в клетках тимуса мышей в норме и при росте экспериментальной гепатомы.
  2. Сопоставить эти изменения с изменением массы и клеточности тимуса и изменением уровня VEGF в циркуляции при росте гепатомы.
  3. Изучить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в перитонеальных макрофагах мышей при росте гепатомы и сопоставить их с теми же показателями в клетках тимуса.
  4. Оценить синтез мРНК VEGF, его рецепторов и TSP-1 перитонеальными макрофагами под действием VEGF in vitro.

Основные положения выносимые на защиту.

  1. Инволюция тимуса при росте опухоли сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF внутри тимуса и не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в циркуляции.
  2. Инволюция тимуса при росте гепатомы сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF в строме тимуса и мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах.
  3. VEGF усиливает синтез мРНК своих рецепторов (VEGFR1 и VEGFR2), экспрессию мРНК своей собственной молекулы, а также TSP-1 в макрофагах мышей in vitro.

Научная новизна. Впервые было показано наличие конститутивной экспрессии генов VEGF и VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Также установлено, что запустевание тимуса при росте гепатомы сопровождается повышением локального синтеза мРНК VEGF в строме тимуса и усилением экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Нами впервые было показано, что в тимоцитах и макрофагах при росте опухоли наблюдается однонаправленное изменение синтеза мРНК VEGFR2. Кроме того, установлено, что экспрессия мРНК VEGF и TSP-1 в макрофагах может быть усилена в присутствии VEGF in vitro.

Теоретическое и практическое значение. Работа носит экспериментально-теоретический характер. На основании проведенных экспериментальных исследований дополнена концепция развития инволюции тимуса при росте опухоли, заключающаяся в локальном усилении синтеза мРНК ангиогенного фактора VEGF стромой тимуса и усилении синтеза мРНК VEGFR2 тимоцитами. При этом показано, что развитие инволюции тимуса, сопровождающее опухолевый рост, может не зависеть от повышения уровня VEGF в циркуляции. Дополнены данные по взаимодействию VEGF и клеток иммунной системы на примере влияния VEGF на синтез ангиорегуляторных молекул макрофагами.

Личный вклад автора в проведение исследований. Все исследования, включающие работу с культурой клеток экспериментальной гепатомы in vitro, работу с опухолевой моделью на лабораторных животных и проведение всех указанных в работе экспериментов, а также статистическая обработка и интерпретация полученных результатов проводились лично автором. Роль соавторов состояла в предоставлении консультативной помощи и технической поддержки на начальных этапах исследования.

Апробация. Основные результаты работы были представлены на Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (2002, 2003, 2004, 2005 и 2006 годов), на конференции молодых ученых «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) и Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006). Материалы докладывались на заседании С.Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 18 декабря 2007г.

Публикации. Результаты работы отражены в 17 публикациях (4 статьи и 13 тезисов).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 48 рисунками. Библиографический указатель включает 177 литературных источников (10 отечественных и 167 иностранных).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 220 мышей-самцов линии C3HA, весом 18-20 г, в возрасте 2 месяца, полученных из питомника “Рапполово” РАМН.

Опухоль. Гепатома 22а из коллекции клеточных культур института цитологии РАН была любезно предоставлена В.А.Ивановым и О.Н. Погодиной. Клетки гепатомы вводили сингенным мышам C3HA подкожно в область спины в количестве 105/мышь. Контрольные животные получали инъекцию забуференного физиологического раствора (ЗФР) в том же объеме.

Животных убивали методом цервикальной дислокации через 7, 14, 21, 28 и 35 сутки после введения клеток опухоли. На каждом сроке исследовали 4 контрольных и 4 опытных животных, опыты повторяли 2-3 раза. Изучали тимусы, клетки перитонеального экссудата (КПЭ) и сыворотку крови.

Получение перитонеальных макрофагов. КПЭ получали путем перитонеального лаважа, инкубировали в течение 2 часов в 24-луночных планшетах, отмывали от не прилипающих клеток и исследовали экспрессию мРНК от каждого животного индивидуально. Для тестов in vitro КПЭ объединяли от 10 животных. Монослой макрофагов, отмытый от не прилипающих клеток, инкубировали в течение 4-24 часов при 37°С и 5%СО2 в присутствии различных факторов: VEGF164(Peprotech), LPS E.coli O55B5 (Sigma) или TNF- (Sanitas, Вильнюс).

Исследование тимуса. Тимусы взвешивали, затем раздавливали в гомогенизаторе в ЗФР и разделяли на две части: тимоциты и строму органа. Получившуюся после раздавливания суспензию тимоцитов фильтровали через нейлоновый фильтр и подсчитывали концентрацию и общее количество клеток на орган. Стромой тимуса считали ткань, оставшуюся на фильтре, которую промывали несколько раз в ЗФР. Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 изучали от каждого животного индивидуально. Для исследования синтеза белка материал предварительно объединяли от нескольких животных.

Метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Экспрессию мРНК в клетках и тканях определяли методом ОТ-ПЦР. Выделение суммарной мРНК проводили с использованием TRI-Reagent (Sigma). Для проведения обратной транскрипции (ОТ) к мРНК добавляли коктейль специфических обратных праймеров (Литех). В качестве внутреннего контроля прохождения ОТ-ПЦР использовали уровень экспрессии мРНК -актина. ПЦР проводили с использованием праймеров, подобранных таким образом, чтобы длина продукта при прохождении реакции с кДНК, полученной в результате ОТ, и ядерной ДНК была разной. В работе использовали следующие праймеры, для VEGF: прямой- 5’ gaccctggctttactgctgta 3’, обратный 5’ gtgaggtttgatccgcatgat 3’; TSP-1: прямой 5’ caaaggagatgcctgtgacc 3’, обратный 5’ ctggaatcgtcggaaatcgg 3’; VEGFR1: прямой 5’ gaagcggttcacctggactgagacc 3’, обратный 5’ ggctttgctggggggatttctctaa 3’; VEGFR2: прямой 5’ acagacagtgggatggtccttgcat 3’, обратный 5’ aaacaggaggtgagctgcagtgtgg 3’; -actin: прямой 5’ atggatgacgatatcgct 3’, обратный 5’ atgaggtagtctgtcaggt 3’. Праймеры для выявления экспрессии мРНК VEGF детектировали все четыре известные изоформы цитокина. Для каждой пары праймеров температуру отжига и концентрацию MgCl2 подбирали индивидуально. Визуализацию ПЦР-продуктов проводили в агарозном геле (Фармация) с добавлением бромистого этидия (ICN). Гели фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата в проходящем УФ-свете. Изображение подвергали компьютерной обработке с помощью программного пакета Adobe Photoshop, после чего проводили денситометрический анализ полученных электрофоретических полос с помощью программы SCNImage.

Вестерн-блот. Определение синтеза белка (VEGFR2) в тимоцитах и строме тимуса проводили при помощи Вестерн-блота. Экстракцию суммарного белка из тимоцитов, стромы тимуса и ткани печени проводили при помощи буфера RIPA (Sigma) с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ (Sigma). Электрофоретическое разделение белков и их детекцию в геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по методике Laemmli, 1970. Перед внесением в гель в пробах измеряли суммарный белок с помощью реактива Бредфорда (Sigma) и наносили для разделения с помощью электрофореза в одинаковой концентрации. После разделения белков с помощью электрофореза их переносили на PVDF-мембрану HyBond (Pharmacia). Мембрану инкубировали 2 часа c поликлональной сывороткой крысы анти-VEGFR2 (Santa Cruz) и 1 час с поликлональной сывороткой кролика против IgG крысы, конъюгированной с пероксидазой хрена (Santa Cruz). Визуализацию продуктов проводили методом хемилюминесценции. Люминесценцию детектировали с помощью анализатора Chemidoc (BioRad). Полученные результаты обрабатывали с помощью программного пакета Adobe Photoshop.

Иммуноферментный анализ. Определение VEGF164 в сыворотке крови животных при росте гепатомы проводили с помощью иммуноферментного набора для определения мышиного VEGF164 (Bender Medsystems).

Статистический анализ полученных результатов проводили согласно критерию Вилкоксона с использованием программы Statistica 5.1

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»