WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Статистическая обработка данных была проведена по стандартным методикам (Рождественский и др., 1974), с использованием программного пакета Microsoft Excel 7.0 для Windows 98. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Для полученных данных рассчитывали среднее значение, среднее квадратичное отклонение. Выводы сделаны с учетом уровня значимости = 0,05.

ГЛАВА 3. Распределение бактерий рода Enterococcus в различных районах озера Байкал, его основных притоках и в реке Ангаре

Проведенные в 2005 г. исследования распределения энтерококков в оз. Байкал показали, что в акватории озера имеются локальные участки, где наблюдается повышенное содержание этих бактерий. Заметное количество представителей рода Enterococcus выявлено в пробах воды, отобранных у пос. Култук, в районе влияния БЦБК, в устье реки Баргузин. В пробах, отобранных на контрольных станциях и во всех глубоководных районах озера, энтерококки методами культивирования обнаружены не были. В исследованиях воды были использованы также молекулярно-биологические методы, которые оказались более чувствительными при определении этой группы микроорганизмов. Бактерии рода Enterococcus молекулярно-биологическими методами были выявлены не только в местах поступления речных вод, но и в пробах воды открытого Байкала, взятых с поверхности на контрольных пунктах. В пелагиали озера, в пробах, отобранных в глубинных слоях, изучаемая группа бактерий не выявлялась даже при применении разнообразных методик выделения. Дополнительные исследования в воде озера, были проведены в 2007 г. и 2008 г. Наибольшие значения численности энтерококков отмечены в пробах воды, отобранных непосредственно в реках, таких как Фролиха, Голоустная, Баргузин, Сарма, Рель, Тыя, Томпуда, Сухая и Бугульдейка.

Детальные исследования были проведены в Южном Байкале и показали, что вода исследуемого района загрязнена энтерококками в той или иной степени. По результатам, полученным за исследуемые периоды, бактерии рода Enterococcus были обнаружены в 30 пробах из 105 в 2006 г. и в 30 пробах из 126 в 2007 г., что составляет 29% и 24% соответственно.

Основное внимание при изучении распределения потенциально-патогенной группы Enterococcus было направлено на их распространение в водной толще дельты реки Селенги как района с высокой антропогенной нагрузкой на озеро. Были проведены подробные исследования этого района в 2006 г. и 2008 г. Высокие значения численности исследуемых бактерий были установлены в самой дельте реки, которая отличается наиболее благоприятными условиями для прогрева вод, накопления и трансформации органического вещества и, как следствие, развития микроорганизмов. Чем дальше от дельты в озеро, тем меньше исследуемых микроорганизмов обнаруживали в пробах воды. Это говорит о том, что даже отрицательное влияние реки Селенги компенсируется особыми условиями Байкала.

В августе 2006 г. были проведены исследования по обнаружению бактерий рода Enterococcus в р. Ангаре - ниже Усть-Илимской ГЭС и до места впадения реки в Енисей. Бактерии рода Enterococcus встречались в верховой части этого отрезка реки, где она испытывает влияние сточных вод Усть-Илимского лесопромышленного комплекса (УИЛПК), а также возле небольших населенных пунктов. Увеличение численности микроорганизмов далее вниз по реке обусловлено поступлением органических веществ и биогенных элементов с водосборной площади.

Таким образом, наличие санитарно-показательных бактерий рода Enterococcus является важным показателем антропогенного воздействия на р. Ангару, оз. Байкал и его притоки.

За период исследований из байкальской воды было выделено 306 штаммов, отнесенных к роду Enterococcus, 120 из которых были идентифицированы до вида.

E. faecalis, который наиболее часто встречается у человека и «ответственен» за 80 – 90% энтерококковых инфекций, составляет 20% в пробах, отобранных в Южном и 12% в Среднем Байкале, и 22% в пробах воды, отобранных в Северном Байкале. В данных районах доминирует E. faecium 47%–26%–45% соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Соотношение видов бактерий р. Enterococcus, изолированных из проб воды оз. Байкал в целом (а), Южного (б), Среднего (в), Северного Байкала (г)

В последние годы для E. faecium, вызывающего 10 – 15% энтероккоковых инфекций, отмечается повышение частоты нозокомиального носительства, связанного, по-видимому, с большей его резистентностью ко многим антибактериальным препаратам (Gordts et al., 1995; Padiglione et al., 2000; Дехнич и др., 2001).

Из исследуемых районов изолированы также штаммы: E. faecium, E. avium, E. faecalis, E. mundtii, E. hirae, E. durans, E. gallinarum. В основном это виды фекального происхождения, и в большинстве случаев они могут рассматриваться как специфические индикаторы загрязнения воды фекалиями человека, животных и птиц. Наибольшим разнообразием видов характеризуются пробы воды, отобранные в Южном и Среднем Байкале. В данных районах представлены семь видов, в отличие от проб Северного Байкала, где обнаружено четыре (рис. 2).

ГЛАВА 4. Гемолитическая активность и антибиотикоустойчивость бактерий рода Enterococcus, выделенных из озера Байкал

Свойства гемолитической активности у бактерий рода Enterococcus, выделенных из озера Байкал, ранее не изучались. На наличие гемолитической активности было протестировано 120 штаммов энтерококков, выделенных из озера Байкал.

В результате проведенных исследований было выяснено, что всего 4% от общего числа проанализированных штаммов энтерококков обладали гемолитической активностью. Гемолитическую активность проявляли культуры, выделенные из проб воды, отобранных в районе п. Култук (Южный Байкал), а также из литоральных областей Среднего Байкала, а именно, районов реки Сухая и реки Селенги. Важно отметить, что ни один штамм бактерий, выделенных из проб северного района озера, не обладал гемолитической активностью, что говорит о наименьшем антропогенном воздействии на этот район.

Проведенные эксперименты по определению антибиотикорезистентности характеризуют данные микроорганизмы как антибиотикочувствительные. Так, из 120 изолированных культур высокой чувствительностью характеризовались микроорганизмы по отношению к гентамицину (95% штаммов), ванкомицину (87%) и тетрациклину (79%) (рис. 3). Промежуточным уровнем резистентности характеризовались микроорганизмы по отношению к эритромицину (55%) и ципрофлоксацину (36%). Выделенные культуры обладали наибольшей резистентностью к рифампицину (30%), стрептомицину (28%) и бензилпеницилину (22%) (рис. 3).

По результатам исследования, E. faecium – вид, который наиболее часто встречается среди изолированных штаммов энтерококков, характеризовался в целом как антибиотикочувствительный.

Необходимо отметить тот факт, что из всей исследуемой коллекции выделено 20 штаммов, для которых характерен промежуточный уровень устойчивости к ванкомицину. Следует сказать, что согласно проведенным исследованиям антибиотикочувствительности энтерококков в России клинических штаммов, резистентных к ванкомицину и тейкопланину, не обнаружено (Сидоренко и др., 1998; Тюрин и др., 2000; Мироненко и др., 2007).

Рис. 3. Суммарная чувствительность бактерий рода Enterococcus к антибиотикам, изолированных из озера Байкал в целом (а), Южного (б), Среднего (в), Северного Байкала (г)

ГЛАВА 5. Изучение выживаемости и адаптации условно-патогенных

бактерий рода Enterococcus в условиях лабораторного моделирования

Исследования способности выживания энтерококков в окружающей среде представляют наибольший интерес в свете проблем сохранения чистоты природных вод и использования их в качестве питьевой воды без нанесения ущерба здоровья потребителям. На основе анализа литературных данных и проведенных собственных исследований было сделано предположение, что обнаружение энтерококков в воде молекулярно-биологическими методами, а не методами культивирования, связано с переходом их в некультивируемое, но жизнеспособное состояние. Многие бактерии могут входить в VBNC состояние при неблагоприятных условиях окружающей среды (Barer et. al., 1993; Oliver 1993; Satta et. al., 1994).

В байкальской воде энтерококки встречаются как с условиями низкой температуры, так и с условиями низких концентраций питательных веществ. Поэтому наибольший интерес представляет изучение сочетания действия основных абиотических факторов – температурного и трофического на самый распространенный в воде озера вид – Enterococcus faecium.

На рис. 4 а видно, что клетки штамма Ent. 8 на 12 сутки перестают культивироваться в байкальской воде при 4оС и 24оС, но при добавлении питательных веществ бактерии вновь переходили из некультивируемого состояния в культивируемое. Исключение составили бактерии, культивируемые при 37оС, где сразу шло снижение численности клеток и, в конце концов, наступала их гибель. Это можно объяснить тем, что штамм Ent. 8, выделенный из озера Байкал, приспособлен к низким положительным температурам озера, а 37оС является экстремальным для его развития.

При исследовании культивирования штамма S 11 были получены данные, представленные на рис. 4. б, которые показали, что для штамма, выделенного из реки Селенги, температура 37оС не является критической, но при этой температуре энтерококки без увеличения численности быстрее впадают в некультивируемое, но жизнеспособное состояние. Вероятно, это связано с тем, что вода в реке прогревается до более высоких температур, чем в самом озере, и поэтому клетки штамма S 11 легче адаптируются к разным температурным условиям. При культивировании штамма S 11 при 4оС и 24оС результаты оказались такими же, как при культивировании штамма Ent. 8 при тех же температурах. В этих условиях энтерококки культивировались гораздо более длительный период времени, чем при температуре 37оС, и с понижением температуры увеличивалась выживаемость энтерококков, что находит подтверждение в литературе (Алтон, 1980; Филимонова, 1983; Bunker et al., 2004). При добавлении питания клетки вновь переходили в стадию культивированного состояния.

Рис. 4. а – Культивирование Ent. 8 в байкальской воде при разных температурах; б – культивирование S 11 в байкальской воде при разных температурах

Дальнейшие исследования некультивируемого, но жизнеспособного состояния при помощи электронной микроскопии показали, что происходят изменения размеров клетки и ее клеточной стенки (рис. 5). Это, по-видимому, способствует выживанию исследуемых бактерий, как при низких температурных условиях, так и недостаточном для их жизнедеятельности количестве органического вещества. Клетки при выходе из жизнеспособного, но некультивируемого состояния, «скидывают» верхний слой клеточной оболочки (рис. 6 б - д) и в дальнейшем эти же клетки вполне жизнеспособны и после адаптационного периода способны к размножению (рис. 6 е).

Рис. 5. Электронные микрофотографии (ТЕМ) развития бактерий: а, б, в – морфология клеток в культивируемом состоянии; г, д, е – при переходе в некультивируемое, но жизнеспособное состояние; ж, з, и – морфология клеток после процесса «реанимации»

Таким образом, в экспериментальных условиях установлен один из возможных механизмов выживания и сохранения жизнеспособности энтерококков в байкальской воде. Сохранение клетки в байкальской воде при низкой ее температуре происходит за счет образования более плотной и большей по толщине клеточной стенки, которая увеличивается в размерах в несколько раз. Следует отметить, что эти микроорганизмы используются как индикаторы фекального загрязнения воды, поэтому наибольший интерес состояние жизнеспособности, но некультивируемости представляет для процедуры санитарно-гигиенического состояния и качества питьевой воды, а также для мониторинга природных вод.

Рис. 6. Электронные микрофотографии (ТЕМ) клеток энтерококков: а – клетка в некультивируемом, но жизнеспособном состоянии; б-д – клетки энтерококков после процесса «реанимации»; е – делящаяся клетка после VBNC состояния

5.2. Изучение влияния химических и физических факторов на выживание энтерококков в воде озера Байкал в экспериментальных условиях

Хлорирование воды в России – наиболее распространенный метод обеззараживания воды с 1910 года. Действие хлора проявляется особенно сильно в течение первых 30 мин. контакта. При этом из патогенных микроорганизмов наиболее чувствительны к хлору возбудители брюшного тифа, дизентерии и холеры. Паратиф В, энтерококки, а также вирусы являются более резистентными.

При изучении устойчивости бактерий рода Enterococcus к различным концентрациям хлора было выяснено, что максимальные концентрации гипохлорита кальция в стерильной воде, без добавления питательных веществ, на бактерии рода Enterococcus производят сильный бактерицидный эффект. Однако в стерильной байкальской воде при меньших концентрациях хлора, равных 0,6 мг/л и 0,3 мг/л, бактерии все еще продолжают культивироваться даже после 30-минутной обработки, и только по истечению 3 часов погибают. Обратная картина наблюдается при культивировании данных микроорганизмов в байкальской воде с различными концентрациями хлора при наличии питательных веществ. При этом жизнеспособные клетки выявляются даже при действии максимальных концентраций хлора после 30-минутной обработки. Через сутки бактерии рода Enterococcus не только не погибают в данных условиях, но и активно развиваются и наращивают свою биомассу. Дальнейшие исследования при помощи сканирующей и трансмиссионной микроскопии показали, что при наличии питания клетки не изменяют свою морфологию при воздействии на них как минимальных, так и максимальных концентраций хлора (рис. 7).

В результате эксперимента установлено, что при концентрациях хлора равных 0,6 мг/л и 0,3 мг/л клетки энтерококков остаются жизнеспособными даже после 30-минутной обработки. Эта устойчивость особенно опасна в аспекте загрязнения водопроводных сетей, так как водопроводные сети являются потенциальным источником вторичного микробного загрязнения на изношенных участках и при возникновении аварийных ситуаций.

Рис. 7. Клетки энтерококков в байкальской воде без добавления хлора (А),

они же при действии минимальной (Б) и максимальной концентрации хлора (В)

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»