WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

КРАВЧЕНКО Ольга Сергеевна

БАКТЕРИи РОДА eNTEROCOCCUS В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ: Распределение, ВИДОВОЙ СОСТАВ, механизм АДАПТАЦИи

03.00.16 – экология

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Улан-Удэ, 2009

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

ст.н.с., Парфенова Валентина Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Намсараев Баир Бадмабазарович

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Савилов Евгений Дмитриевич

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Медицинских Наук, НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского Отделения РАМН, Владивосток

Защита состоится «14» мая 2009 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.212.022.03 при Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а, биолого-географический факультет, конференц-зал. Факс: (3012)21-05-88, e-mail: d21202203@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Бурятского государственного университета.

Автореферат разослан «13» апреля 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, Н. А. Шорноева

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Систематические исследования бактерий рода Enterococcus, относящихся к индикаторной потенциально-патогенной группе микроорганизмов, входящие в перечень показателей качества вод, в озере Байкал ранее не проводились. В течение многих лет микроорганизмы этого рода рассматривали как клинически малозначимые. Пересмотр оценки патогенетической роли энтерококков способствовало обнаружение у микроорганизмов факторов вирулентности. В последние годы роль микроорганизмов, относящихся к роду Enterococcus, возросла не столько из-за их широкого распространения, сколько из-за приобретения ими устойчивости к подавляющему большинству доступных антибактериальных препаратов, к высушиванию, свету, низкой температуре, а также к действию физических, химических и биологических факторов (The Enterococci…, 2002).

Кроме того, согласно многочисленным исследованиям, патогенные и непатогенные микроорганизмы способны переходить в некультивируемое состояние («viable but nonculturable state» (VBNC)), при котором клетки на питательной среде колоний не образуют, но при этом остаются жизнеспособными (Kell et. al., 1998; Oliver, 2005). Возможно, этот механизм позволяет сохраняться в воде Байкала различным группам микроорганизмов, в том числе и потенциально–патогенным. Изучение возможного постоянного поступления потенциально-патогенных бактерий в озеро и сохранения ими своей жизнеспособности в воде в комплексе с другими группами микроорганизмов очень важно, прежде всего, с точки зрения оценки качества байкальской воды.

Цель исследования: изучение особенностей распространения и видового состава бактерий рода Enterococcus в различных районах озера Байкал, установление механизма адаптации энтерококков, позволяющего длительное время сохранять жизнеспособное состояние в особых экологических условиях озера.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать количественное распределение бактерий группы Enterococcus в воде озера Байкал, его основных притоках и в реке Ангаре;

2. определить видовой состав микроорганизмов рода Enterococcus, выделенных из воды озера Байкал;

3. изучить гемолитическую активность и антибиотикорезистентность бактерий рода Enterococcus, выделенных из воды озера Байкал;

4. в лабораторных условиях установить один из возможных механизмов выживания бактерий рода Enterococcus в байкальской воде;

5. провести модельные эксперименты по влиянию химических и физических факторов на выживание бактерий рода Enterococcus в воде озера Байкал.

Научная новизна. Впервые исследовано количественное распределение и видовой состав бактерий рода Enterococcus в различных районах озера Байкал, в его основных притоках и в реке Ангаре. Установлены видовой состав энтерококков, выделенных из акватории озера Байкал, и факторы их патогенности. Впервые в экспериментальных условиях на примере бактерий рода Enterococcus рассмотрены адаптационные возможности выживания грамположительных бактерий в особых экологических условиях Байкала в результате перехода их в некультивируемое состояние. Выяснено, что сохранение жизнеспособности связано с изменением структуры клеточной стенки. Проведены экспериментальные работы по изучению влияния используемых методов дезинфекции на рост и развитие бактерий рода Enterococcus.

Практическая значимость. Полученные данные о распределении и видовом составе бактерий рода Enterococcus являются индикаторами антропогенного влияния на озеро Байкал и могут быть использованы в качестве дополнительных показателей при организации комплексного микробиологического мониторинга. Показано, что антибиотикорезистентность и гемолитическая активность бактерий рода Enterococcus могут служить дополнительными критериями патогенности водных бактерий, которые необходимо учитывать при оценке качества воды озера Байкал. Сформированная коллекция культур бактерий рода Enterococcus, выделенных из различных районов озера Байкал, может быть использована при оценке эффективности процессов дезинфекции, что особенно важно при подготовке питьевой воды, которая должна использоваться с учетом ее безопасности для потребителей.

Защищаемые положения:

1. В озере Байкал бактерии рода Enterococcus приурочены к литоральным районам озера, прилегающим к населенным пунктам, и его основным притокам. Изолированные штаммы фекального происхождения E. faecium, E. avium, E. faecalis, E. mundtii, E. hirae, E. durans, E. gallinarum могут рассматриваться как специфические индикаторы санитарно-бактериологического состояния качества воды.

2. Адаптация и сохранение жизнеспособности бактерий рода Enterococcus в байкальской воде обусловлены переходом их в некультивируемое, но жизнеспособное состояние за счет изменения структуры клеточной стенки.

3. Устойчивость бактерий рода Enterococcus к воздействию хлора и озона повышается в присутствии органических веществ, что необходимо учитывать при водоподготовке питьевой воды.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: Всероссийской конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006); II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006); Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); II Международном Байкальском Микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск - п. Листвянка, 2007); III Международной конференции молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция» (Одесса, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно–технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы» (Москва, 2007); Международном симпозиуме «Контроль и реабилитация окружающей среды: КРОС – 2008» (Томск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008); International Symposium (Australia, 2008); IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно–технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы» (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 3 статьи опубликованы, 2 – приняты в печать, 11 тезисов и получено одно свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2009620013.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, трех глав, изложенных на основании собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (152 источника, из них 97 – зарубежных) и приложений. Объем работы составляет 143 страницы машинописного текста, включающего 12 таблиц, 32 рисунка и 2 приложения.

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю, зав. лабораторией, к.б.н. Парфеновой В. В. за постановку задач и помощь в проводимых исследованиях, а также Павловой О. Н., Захаровой Ю. Р., Косторновой Т. Я., Сусловой М. Ю., Бедашвили Е., Фикель Я., Обст У. и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии ЛИН СО РАН за оказанную помощь при выполнении работ и обсуждении результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

Приведены литературные данные по таксономии и физиолого-биохимической характеристике бактерий рода Enterococcus. Рассмотрены антибиотикорезистентность, гемолитические свойства и клиническое значение исследуемых бактерий, а также механизмы адаптации и выживания энтерококков в низкотемпературных условиях среды. Обсуждается роль представителей рода Enterococcus в оценке качества воды.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

За весь период исследования с 2005 по 2008 гг. было отобрано и проанализировано 500 проб воды на 61 станции озера Байкал. В чистую культуру было выделено 306 штаммов микроорганизмов, отнесенных к роду Enterococcus, для 120 штаммов определен видовой состав, антибиотикорезистентность и гемолитическая активность. Нами проведено 35 серий экспериментов.

Объектами данного исследования являются озеро Байкал, его основные притоки и река Ангара. Пробы воды отбирали в 2005 - 2008 гг. в стерильные флаконы батометром и обрабатывали по общепринятым методикам (Романенко, 1974). Распределение, численность, видовой состав бактерий рода Enterococcus были изучены в поверхностных и глубинных слоях воды, взятых на станциях стандартных центральных гидрологических разрезов в Южном, Среднем и Северном Байкале, а также в устьях рек (рис. 1).

Рис. 1. Карта-схема станций отбора проб воды:

– точки отбора проб

Для выделения колоний из водных образцов и учёта численности бактерий рода Enterococcus использовали метод посева на бактериальных фильтрах. Объем воды (50 мл) пропускали через фильтр, который помещали на селективную среду Сланеца-Бертли. Инкубацию посевов проводили при 37°С в течение 48 ч. (Санитарно-микробиологический.., 2005). Для уточнения результата фильтр с выросшими колониями переносили на среду, содержащую желчь, эскулин и железо (III) лимонноаммиачное. Посевы на данной среде инкубировали при 44°С в течении двух часов. Образование черного пигмента, диффундирующего в среду, свидетельствует о положительном результате при определении бактерий рода Enterococcus в воде (EN ISO 7899-2: 2000).

Для обнаружения в пробах воды бактерий рода Enterococcus применяли молекулярно-биологический метод (ПЦР-анализ) с родо-специфическими праймерами.

Видовую идентификацию культур проводили по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам в соответствии с современными принципами классификации (Manero et. al., 1999). Для этого определяли следующие признаки: посев на косяки для получения суточной культуры и окраска по Грамму, наличие у чистых культур микроорганизмов сахаролитической и каталазной активностей, способность к редукции теллурита калия, к гидролизу аргенина и эскулина, способность роста при 45С, при 50С, а также определение их гемолитической активности (Определитель бактерий Берджи, 1997; Manero et. al., 1999; Справочник по микробиологическим…, 1967).

Антибиотикорезистентность изолированных штаммов определялась диско-диффузионным методом, на среде Мюллера-Хинтона, с использованием восьми антибиотиков: стрептомицин, тетрациклин, ванкомицин, бензилпенициллин, ципрофлоксацин, эритромицин, гентамицин, рифампицин. Анализ материала проведен по трем группам: чувствительные, промежуточные и устойчивые (Определение чувствительности…, 2004).

Изучение адаптационных механизмов роста и развития энтерококков в байкальской воде проводили в лимитируемых условиях с лабораторными культурами E. faecium, выделенными из разных районов озера Байкал. Первый штамм, Ent. 8, был выделен в 2005 г. из вод озера Байкал у поселка Култук, а второй, S 11 - в 2006 г. из протоки Галута устья реки Селенги. В колбы с нестерильной байкальской водой объемом 100 мл вносили посевной материал. Далее по контрольным высевам определяли кривые развития бактерий при разных температурных условиях: 4С, 20С, 37С. Изучения морфологии и изменений внутриклеточной структуры энтерококков проводились методом трансмиссионной и сканирующей микроскопии.

Для изучения влияния химических факторов на выживание энтерококков проводили эксперименты при действии гипохлорита кальция. Эксперимент был проведен в байкальской воде со штаммом E. faecium при наличии и без питательного вещества. В колбы с байкальской водой объемом 100 мл вносили посевной материал и различное количество гипохлорита кальция. Для определения количественного содержания и характера развития бактерий в колбах отбирали аликвоты воды по 1 мл, которые высевали на селективный эскулиновый агар с азидом и канамицином и культивировали в течение суток при 37С.

Для изучения влияния физических факторов на выживание энтерококков в воде озера Байкал в экспериментальных условиях использовали штамм E. faecium. В колбы с озонированной байкальской водой объемом 100 мл вносили посевной материал. Эксперимент проводили в байкальской воде без добавления и при добавлении питательного вещества. Озонирование байкальской воды проводилось на предприятии по производству бутылированной воды ООО «Вода Байкала» на инжекторной системе Вэнтури, компании Olmsted Ozone, Германия. Количество начального и остаточного озона в колбах проверяли прибором OAKTON Instruments (USA).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»