WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

50

34,7

80

H2O

38,1

8

0,0

0

0

0

ДНК Ureaplasma sp. 109

37,8

52

33,2

850

0

0

ДНК Chlamidia sp. 109

37,2

230

34,0

1 200

0

0

ДНК Leptospira sp.109

22,6

5,8х107

26,0

7,6х106

0

0

* 1 геномный эквивалент C. burnetii содержит 19-31 копию последовательности IS1111;

§ содержание геномов C. burnetii/мл

Таким образом, появление неспецифического положительного сигнала в образце, не содержащем ДНК C. burnetii, при использовании обоих наборов праймеров явилось существенным недостатком метода ПЦР-РВ SYBRGreen I.

Для проведения ПЦР-РВ TaqMan использовали праймеры, амплифицирующие фрагмент гена icd C. burnetii (Klee S. et al., 2006). На основе анализа нуклеотидной последовательности гена icd (СP 001019), ограниченной праймерами icd, был разработан специфический внутренний зонд, меченный флуоресцеином (FAM). Оптимизацию условий ПЦР-РВ TaqMan проводили с использованием тех же положительных и отрицательных контрольных образцов, что и в случае ПЦР-РВ SYBRGreen I. Как и в случае с SYBRGreen I, наблюдалась прямая зависимость между значением порогового цикла детекции флуоресценции и концентрацией ДНК-матрицы (таблица 2). При этом во всех отрицательных контролях, не содержащих ДНК C. burnetii, репортерная флуоресценция отсутствовала. Чувствительность обоих методов ПЦР-РВ, SYBRGreen I и TaqMan, для выявления ДНК C. burnetii была сопоставима (таблица 2). При этом специфичность ПЦР-РВ TaqMan (97,2%) превышала достигнутую в ПЦР-РВ SYBRGreen I (74,1%).

Таблица 3. Результаты исследования образцов биологического материала на наличие ДНК C. burnetii методом ПЦР-РВ TaqMan

Исследуемый образец

Результат в ПЦР на

наличие C. burnetii

Значение порогового цикла (Ct )

ГЭ

C.burnetii

Цельная кровь пациента с лихорадкой неустановленной этиологии

отрицательный

0

0

Селезенка интактной лабораторной мыши

отрицательный

0

0

Почка интактной лабораторной мыши

отрицательный

0

0

Селезенка лабораторной мыши, зараженной C. burnetii 108 кл/ 1 мкг ткани

положительный

17,0

3х10 9

Почка лабораторной мыши, зараженной C. burnetii 108 кл/ 1 мкг ткани

положительный

18,2

1, 7х109

Почка рыжей полевки -1, Северное кладбище

положительный

32,3

2,3х104

Селезенка рыжей полевки -1, Северное кладбище

положительный

32,0

2,8х104

Селезенка рыжей полевки -2, Северное кладбище

положительный

31,8

2х105

Селезенка рыжей полевки -3, Северное кладбище

положительный

33,6

1,8х104

Почка рыжей полевки -4, Северное кладбище

положительный

34,2

1,5х104

Селезенка рыжей полевки -5, Северное кладбище

положительный

32,2

4,4х104

Селезенка бурозубки обыкновенной, Северное кладбище

положительный

31,2

6,7х104

Почка бурозубки обыкновенной, Северное кладбище

положительный

31,2

5,2х104

Селезенка рыжей полевки-1, Ржевский лесопарк

положительный

32,2

2,5х104

Селезенка рыжей полевки-2, Ржевский лесопарк

положительный

33,7

1,1х104

Почка бурозубки обыкновенной, Ржевский лесопарк

положительный

31,2

6,7х104

Селезенка бурозубки обыкновенной-1, ст. Морская

положительный

33,5

1,4х104

Почка бурозубки обыкновенной-2, ст. Морская

положительный

34,1

9х104

Метод ПЦР-РВ TaqMan с праймерами icd был апробирован на образцах органов диких мелких млекопитающих, положительных на наличие ДНК C. burnetii по результатам стандартной ПЦР с праймерами groЕL. Во всех положительных пробах было обнаружено присутствие ДНК C. burnetii, ни в одной из заведомо отрицательных проб сигналов обнаружено не было (таблица 3).

Таким образом, метод ПЦР-РВ TaqMan, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью, может быть рекомендован для выявления генома C. burnetii в различных образцах, включая образцы биологического материала человека. Данная технология ПЦР-РВ позволяет избежать как стадии контроля результатов реакции с помощью электрофореза, так и необходимости анализа кривой плавления, что снижает продолжительность и трудоемкость исследования, а также исключает риск появления ложноположительных результатов вследствие контаминации продуктами ПЦР.

3. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов C. burnetii

С целью изучения генетической структуры популяции C. bunetii был проведен анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) гена groEL 14 штаммов возбудителя Ку-лихорадки, выделенных на территории Российской Федерации, республик бывшего СССР, Европы и Монголии.

Паттерны рестрикции ампликона groEL всех исследуемых штаммов были идентичны друг другу и совпадали с прогнозируемыми (CP 001019, CP 001020, AE 016828): для эндонуклеазы HhaI (Hin6I) - фрагменты рестрикции 22 п.н., 122 п.н. и 450 п.н.; для эндонуклеазы MnlI - фрагменты 80 п.н. и 514 п.н.; для эндонуклеазы HpaII - отсутствие фрагментов рестрикции. Таким образом, установлена однородность по участку генома groEL штаммов C. burnetii, выделенных из различных источников на территориях бывшего СССР в период с 1954 по 1987 г.г., что согласуется с результатами предыдущих исследований тотальной хромосомной ДНК этих штаммов методом ПДФР (Демкин В.В., Токаревич Н.К., 1993).

Однородность гена groEL изученных штаммов C. burnetii при исследовании методом ПДФР послужила предпосылкой к секвенированию данного ампликона штамма Ixodes–3–Луга. Полученная нуклеотидная последовательность депонирована в GenBank (EF627450); ее гомология с нуклеотидными последовательностями, представленными в GenBank достигала 99%.

Установленный путем секвенирования полиморфизм множественных спейсеров хромосомной ДНК C. burnetii явился предпосылкой для разработки метода мультиспейсер-типирования штаммов на основе анализа различных комбинаций нуклеотидных последовательностей (аллелей) межгенных участков (спейсеров) (Glazunova O. et al., 2005). Из 68 изученных, успешно амплифицировались десять спейсеров: сох 2, сох 5, сох 18, сох 20, сох 22, сох 37, сох 51, сох 56, сох 57 и сох 61. Спейсеры cox18, cox 22, cox 51, cox 56, cox 57, сох61 обладали большей вариабельностью по сравнению с остальными. Спейсеры сox 2, cox 5, cox 20, cox 37, несмотря на относительную консервативность нуклеотидных последовательностей, оказались единственно пригодными для дифференциации некоторых штаммов.

Была проведена амплификация перечисленных десяти спейсеров 174 штаммов C. burnetii из 24 стран мира с последующим секвенированием каждого образца. Для каждого из спейсеров было выявлено от 7 (спейсер 5) до 13 (спейсер 56) вариантов сиквенса (табл. 5).

В результате компьютерной обработки результатов секвенирования для каждого из исследуемых штаммов было выявлено 30 вариантов сочетания нуклеотидных последовательностей спейсеров – «типов сиквенса» (ST) и построено филогенетическое дерево (табл. 5, рис. 2).

Таблица 5. Варианты нуклеотидных последовательностей десяти спейсеров (сох) C.burnetii

Тип сиквенса (ST)

Спейсер (сox)

2

5

18

20

22

37

51

56

57

61

1

5

6

3

4

6

5

8

1

5

6

2

5

6

3

5

6

5

8

1

5

6

3

5

6

3

4

6

7

8

1

5

6

4

5

6

3

2

6

5

8

1

5

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»