WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Москва), используя набор реактивов «Амплификация ДНК» НПО «Силекс М» (Москва). Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом спектре.

ПЦР-РВ проводили в режиме автоматической амплификации на приборе ДТ-322 «ДНК-технология» (Москва), используя комплекты реагентов для ПЦР-РВ (ОАО «Синтол», Москва). Объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал: 2,5 мМ каждого дНТФ; 10х ПЦР буфер; 25 мМ МgCl2; праймеры, по 300 нМ каждого, 25 ед. Taq ДНК-полимеразы с игибирующими активность фермента антителами; деионизированную воду. Дополнительными компонентами служили: для ПЦР-РВ SYBRGreen I - интеркалирующий краситель SYBR Green I в концентрации 9,4 мкг/мкл; для ПЦР-РВ TaqMan - зонд, меченный флуоресцеином - 100 нМ.

Рестрикцию амплифицированных фрагментов ДНК, выделенных из геля с использованием набора «DNA Extraction Kit K0513» (MBI «Fermentas», Литва), проводили с помощью эндонуклеаз HpaII, Hin6I, MnlI (MBI «Fermentas», Литва) согласно инструкциям производителя.

Проведено секвенирование продуктов амплификации десяти межгенных промежутков: cox 2, cox 5, cox 18, cox 20, cox 22, cox 37, cox 51, cox 56, cox 57, cox 61 и фрагмента гена groEL с использованием «Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 2.0» (Ready Reactions, PE Biosystems, France) с 4 пкМ праймеров. Гель-элетрофорез проводили на автоматическом секвенаторе 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, USA). Продукты амплификации были предварительно очищены с помощью набора реагентов Multi Screen PCR (Millipore Corp., MA). Сиквенсы ДНК обрабатывали и компилировали с помощью программы AutoAssembler 2,0. Сравнение сиквенсов ДНК всех десяти межгенных участков выполняли с помощью программы CLUSTAL X (1.8). Филогенетический анализ осуществляли методом UPGMA, основанным на вычислении коэффициента сходства Дайса (Dice L., 1945), с применением программы Mega, версия 2.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация метода ПЦР для выявления С. burnetii в полевом и клиническом материале.

Установлено, что использование праймеров dnaJ1 (Tokarevich N., Mossienko E., et al., 2001), праймеров IS11112 (Raoult D., 2005), праймеров сох 563 (Glazunova O., et al., 2005) позволяет амплифицировать специфические фрагменты в образцах, содержащих ДНК C.burnetii (штамм Henzerling) (рис. 1, дорожки 2); в отрицательных образцах, содержащих ДНК микроорганизмов (Leptospira interrogans) (рис. 1, дорожки 3), продукты амплификации отсутствовали. Однако выявлено неспецифическое связывание праймеров IS1111, cox56 и dnaJ с человеческой ДНК, выделенной из образца крови здорового донора (рис. 1, дорожки 1) и крови интактной морской свинки (на рис. 1 не показано).

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации с наборами праймеров groEL, IS1111, cox56, dnaJ.

1 – суммарная ДНК, выделенная из образца крови здорового донора; 2 - ДНК C. burnetii (штамм Henzerling); 3 – ДНК Leptospira interrogans; М – маркер молекулярного веса (100 – 1000 п.н. с шагом 100 п.н.)

Это обусловило необходимость разработки праймеров к гену groEL (1561 п.н.). Данный ген был выбран в качестве мишени для амплификации с учетом видовой специфичности, внутривидовой консервативности, антигенной активности кодируемого им белка-шаперонина Hsp60, ассоциированного с вирулентностью возбудителя (Lemos J.A. et al., 2007). ПЦР с использованием сконструированных праймеров, ограничивающих фрагмент хромосомной ДНК 644 - 1257 п.н. протяженностью 594 п.н., обеспечивала появление соответствующего продукта амплификации участка гена groEL C. burnetii (рис. 1, дорожка 2). При этом в образцах, не содержащих ДНК C. burnetii, неспецифические продукты амплификации выявлены не были (рис. 1, дорожки 1, 3). Специфичность праймеров подтверждалась как контролями, содержащими ДНК человека, морской свинки и белой мыши, так и сравнением с нуклеотидными последовательностями других организмов (база данных BLAST): гомология последовательностей праймеров и амплифицируемого фрагмента с ДНК эукариотических организмов отсутствовала. Чувствительность метода ПЦР для выявления C. burnetii с различными наборами праймеров была сопоставима, и позволяла выявлять 100-1000 ГЭ в пробе.

Успешное применение праймеров groEL при амплификации контрольных образцов позволило провести исследование методом ПЦР 276 образцов органов (почки и селезенка) 144 диких мелких млекопитающих, отловленных в весенне-летний период 2006-2007 гг. на территории лесопарковых зон Санкт-Петербурга. ДНК C. burnetii была обнаружена у 11 (7,64%) особей - представителей двух видов: полевка рыжая (Clethrionomys glareolus) и бурозубка обыкновенная (Sorex araneus) (таблица 1).

Таблица 1. Частота выявления С. burnetti у особей различных видов диких мелких млекопитающих

Вид

Место отлова

Число особей

Наличие ДНК

C. burnetii (%)

Полевка рыжая

Северное кладбище, Удельный парк, Ржевский лесопарк, Ст. Морская

68

3 (4,4%)

Бурозубка обыкновенная

Северное кладбище, Удельный парк, Ржевский лесопарк

35

8 (23%)

Бурозубка малая, средняя бурозубка, полевая мышь, малая лесная мышь, желтгорлая мышь, лесная мышь, обыкновенная полевка

Северное кладбище, Удельный парк, Ржевский лесопарк, Павловский парк, ст. Морская, парк Александрино, Сестрорецкий разлив, Стрельна

41

0

Итого

144

11 (7,6%)

Таким образом, для выявления C. burnetii, в том числе в полевом материале, по критериям чувствительности и специфичности наиболее эффективна ПЦР с праймерами groEL.

2. Сравнительная эффективность технологий ПЦР-РВ SYBRGreen I и ПЦР-РВ TaqMan для выявления и оценки количественного содержания C. burnetii в образцах биологического материала.

Для выявления C. burnetii в различных образцах с помощью ПЦР-РВ SYBRGreen I использовали наборы праймеров, позволяющие амплифицировать фрагменты генов IS1111 (Fenollar F. et al., 2004) и icd (Klee S. et al., 2006). Оптимизацию условий реакции осуществляли, используя в качестве положительного контроля ДНК вакцинного штамма C. burnetii М44 10-1010 ГЭ/мл, в качестве отрицательных образцов - ДНК различных микроорганизмов (Leptospira spp., Ureaplasma spp., Chlamidia spp.) 109 ГЭ/мл, а также тотальную ДНК, выделенную из образцов цельной крови доноров.

Сначала были подобраны условия проведения ПЦР, позволившие достигнуть максимальной чувствительности (96%) и специфичности (71,4%) амплификации с обоими наборами праймеров.

Как видно из таблицы 2, при указанных параметрах значения порогового цикла детекции флуоресценции различались при использовании различных концентраций ДНК вакцинного штамма C. burnetii М44 для амплификации с праймерами, ограничивающими участки гена icd и IS1111.

При этом для каждого набора праймеров наблюдалась прямая зависимость между значением порогового цикла детекции флуоресценции и концентрацией ДНК C. burnetii. Однако репортерная флуоресценция была отмечена также в образцах, не содержащих ДНК C. burnetii М44.

Появление неспецифической репортерной флуоресценции могло быть обусловлено свойством интеркалирующего красителя SYBR Green I связываться с любой двухцепочечной ДНК (Zipper H., Brunner H., et al., 2004; Gudnason H., Dufva M., et al., 2007), для подтверждения чего потребовались дополнительные исследования. Электрофорез амплифицированных фрагментов показал, что во всех положительных пробах независимо от концентрации матрицы C. burnetii М44 образуется только один искомый специфический фрагмент: 195 или 76 п.н. для праймеров IS1111 или icd, соответственно. В отрицательных образцах указанные фрагменты обнаружены не были. Однако в случае Leptospira spр. при электрофорезе наблюдали неспецифический амплифицированный фрагмент ДНК (размером 100 п.н.). Кроме того, во всех пробах при электрофорезе выявляли фрагменты, характерные для димеров праймеров. Анализ кривой плавления продуктов амплификации подтвердил данные электрофореза: для специфического продукта амплификации характерно образование пика в диапазоне температур плавления 83° С - 85° С, тогда как для димеров праймеров - в диапозоне 80 С – 82 С.

Таблица 2. Сравнительная оценка параметров ПЦР-РВ SYBRGreen I и TaqMan

Исследуемый образец

ПЦР-РВ SYBR Green I

ПЦР-РВ TaqMan

IS1111 праймеры*

iсd праймеры

iсd праймеры

Значение порогового цикла (Ct )

ГЭ

C. burnetii

Значение порогового цикла (Ct )

ГЭ

C. burnetii

Значение порогового цикла (Ct )

ГЭ

C. burnetii

ДНК C. burnetii М44 1010 §

12,7

3х109

15,6

2,2х109

18,3

3,4х109

ДНК C. burnetii М44 109

15,2

2,6х109

18,8

4,8х108

20,3

1,5х109

ДНК C. burnetii М44 108

18,7

4,6х108

20,8

1,2х107

25,1

2х108

ДНК C. burnetii М44 107

22,8

6,2х107

26,2

8х106

26,4

4х107

ДНК C. burnetii М44 106

28,2

3,5х106

30,4

7х105

28,3

4,5х106

ДНК C. burnetii М44 105

32,6

4,5х104

31,6

1х105

32,1

3х105

ДНК C. burnetii М44 104

33,0

3,4х103

32,8

1х104

33,2

1х104

ДНК C. burnetii М44 103

34,2

2,4х102

33,1

2,5х103

33,8

1,6х103

ДНК C. burnetii М44 102

36,7

840

34,9

900

34,1

600

ДНК C. burnetii М44 101

37,9

60

37,0

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»