WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

Фрейлихман Ольга Александровна

ВЫЯВЛЕНИЕ, ТИПИРОВАНИЕ

И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

COXIELLA BURNETII

03.00.07 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Токаревич Николай Константинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Дмитриев Александр Валентинович

доктор медицинских наук, профессор Тец Виктор Вениаминович

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской Академии медицинских наук

Защита диссертации состоится сентября 2009 года в на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Ку-лихорадка – природно-очаговое инфекционное заболевание, представляющее важную медико-социальную проблему в связи с широким распространением возбудителя в различных климато-географических зонах мира, многообразием путей передачи инфекции (воздушно-пылевой, пищевой, трансмиссивный), профессиональным характером заражения лиц, занятых в животноводстве, значительными экономическими потерями, обусловленными инфицированием сельскохозяйственных животных.

Высокоустойчивый во внешней среде возбудитель Ку-лихорадки, Coxiella burnetii, является причиной спорадических заболеваний, эпидемических вспышек и может быть использован в качестве потенциального агента биотерроризма (Pappas G., Blanco J.R., 2007; Azad A.F., 2007; Tissot-Dupont H, Raoult D., 2008).

Сложившиеся в последнее десятилетие в России социально-экономические условия создают реальные предпосылки подъема заболеваемости населения Ку-лихорадкой. Так, частота обнаружения антител к C. burnetii у здоровых лиц увеличилась за последние годы в несколько раз и составила 16,0% и 11,0% в 2002 и 2003 г.г. против 1,1% и 1,8% в 1993 и 1994 г.г., соответственно (Беляев Е.Н. и др., 2001). Наблюдаемое при этом отсутствие корреляции между относительно высоким уровнем серопозитивности и низким уровнем официально регистрируемых случаев Ку-лихорадки обусловлено гиподиагностикой инфекции и типично не только для России, но и для ряда европейских стран. Это связано с многообразием клинических проявлений Ку-лихорадки, поздним появлением антител к коксиеллам, сложностью культивирования возбудителя, накопление которого в куриных эмбрионах или в культуре эукариотических клеток трудоемко и сопряжено с большими временными затратами. Иммунологические методы выявления C. burnetii с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА) недостаточно чувствительны и специфичны (Токаревич Н.К., 1997; Fournier P.E., Raoult D., 2003).

Существенная вариабельность беспозвоночных и позвоночных хозяев, вовлекаемых в эпизоотический процесс Ку-лихорадки (Raoult D., 1999), и способность возбудителя образовывать стойкие природные и хозяйственные очаги делают его выявление особенно актуальным. В настоящее время в России такие очаги практически лишены регулярного наблюдения, и одна из причин этой ситуации – отсутствие эффективных методов обнаружения C. burnetii в полевом материале.

Молекулярно-генетические методы выявления и типирования C. burnetii лишены упомянутых недостатков, и, кроме того, позволяют определить генетические маркеры, пригодные для дифференцирования штаммов возбудителя, что открывает перспективы совершенствования диагностики и эпидемиологического надзора за Ку-лихорадкой.

В последнее десятилетие разработан ряд модификаций метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК C. burnetii в культуре клеток и клинических образцах, в материале от животных и продукции животного происхождения (Willems H., Thiele D., 1994; Tissot-Dupont H. et al., 1999; Beaman M., Hung J., 1989; Rowbotham T., 1999). В России проведено исследование по выявлению возбудителя Ку-лихорадки в полевом материале путем амплификации фрагмента гена белка теплового шока, dnaJ (Tokarevich N., Mossienko E., 2001). Однако метод ПЦР до настоящего времени не нашел широкого применения при мониторинге природных очагов Ку-лихорадки.

Таким образом, недостаток сведений о структуре природных популяций C. burnetii на территории России, несовершенство существующих методов их обнаружения в природных и хозяйственных очагах диктуют необходимость внедрения молекулярно-генетических методов быстрого выявления и типирования коксиелл в полевом материале.

Цель работы

Совершенствование методов выявления и типирования возбудителя Ку-лихорадки в биологическом материале и генотипическая характеристика штаммов C. burnetii различного географического происхождения.

Задачи исследования

  1. Оптимизировать метод ПЦР для выявления C. burnetii в образцах биологического материала.
  2. Оценить эффективность различных модификаций метода ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ) для выявления C. burnetii в образцах биологического материала.
  3. Провести генотипирование штаммов мировой коллекции C. burnetii, в том числе штаммов, выделенных на территории России, c помощью метода анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифицированного гена groEL и мультиспейсер-типирования хромосомной ДНК (анализ нуклеотидных последовательностей множественных межгенных участков – спейсеров).
  4. Изучить генетические связи между штаммами C. burnetii, выделенными на различных территориях, на основе филогенетического анализа множественных спейсеров хромосомной ДНК.

Научная новизна

С использованием метода мультиспейсер-типирования и анализа длин фрагментов рестрикции гена groEL изучена генетическая структура популяции С. burnetii, представленной штаммами, выделенными из различных источников в ряде регионов России. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей множественных спейсеров установлено, что на территории Российской Федерации циркулируют штаммы C. burnetii - представители групп ST23 (85%) и ST7 (15%). Впервые для качественного и количественного определения C. burnetii в полевом материале из природных очагов Ку-лихорадки применен метод ПЦР-РВ на основе амплификации фрагмента гена icd.

Депонировано в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 90 нуклеотидных последовательностей спейсеров (протяженностью 383 - 674 п.н.) девяти штаммов C. burnetii (AY 864199 - AY 864288) и одна нуклеотидная последовательность фрагмента гена groEL штамма Ixodes-3-Луга, протяженностью 594 п.н. (EF627450).

Научно обоснована перспективность применения метода мультиспейсер-типирования для дифференциации штаммов C. burnetii различного географического происхождения.

Практическая значимость

Разработан и апробирован метод ПЦР-РВ в модификации TaqMan с использованием праймеров icd и сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, для выявления и количественного определения фрагмента гена icd штаммов C. burnetii в биологическом материале из природных очагов Ку-лихорадки. Показано, что по показателям чувствительности и специфичности технология ПЦР-РВ TaqMan с использованием сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, превосходит технологию ПЦР-РВ SYBRGreen I с использованием интеркалирующего красителя. Разработаны методические основы оптимизации метода ПЦР-РВ TaqMan для выявления возбудителя у больных на ранних стадиях заболевания Ку-лихорадкой.

Установлена инфицированность C. burnetii диких мелких млекопитающих, свидетельствующая о наличии на территории Санкт-Петербурга в 2006-2007 г.г. активных природных очагов Ку-лихорадки.

Положения, выносимые на защиту

  1. ПЦР с сконструированными праймерами, ограничивающими фрагмент гена groEL, высоко эффективна для выявления C. burnetii в биологическом материале.
  2. ПЦР-РВ с применением сконструированного зонда, меченного флуоресцеином (технология TaqMan), оптимальна для количественного определения C. burnetii в полевом материале.
  3. Штаммы C. burnetii, выделенные на территории России, по результатам анализа полиморфизма межгенных участков хромосомной ДНК, принадлежат к генотипам ST23 и ST7.
  4. Метод мультиспейсер-типирования эффективен для генотипической характеристики штаммов C. burnetii различного географического происхождения.

Апробация работы

Результаты работы доложены на Международной конференции по риккетсиям и риккетсиальным болезням (Любляна, Словения, 4-7 сентября 2002 г.), на заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Санкт-Петербург, 15 мая 2007 г.), на Четвертой международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.).

Личный вклад диссертанта

Формулирование целей и задач, подбор методов исследования выполнены лично диссертантом. Автором лично проводился дизайн праймеров и зондов для ПЦР-РВ и оптимизация ПЦР-РВ, лабораторные исследования биологического материала методами ПЦР и ПЦР-РВ, амплификация и секвенирование межгенных промежутков штаммов российской коллекции C.burnetii при их анализе методом мультиспейсер-типирования, статистическая обработка данных. Соавторами осуществлялась консультативно-методическая помощь и предоставление технической базы для выполнения работы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (13 отечественных и 131 зарубежных источников). Работа изложена на 117 страницах машинописного текста; содержит 14 таблиц, иллюстрирована 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Изучены 178 штаммов C. burnetii: вакцинный штамм М44, 27 штаммов коллекции ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора и 150 штаммов коллекции Европейского референс-центра по изучению риккетсий,

г. Марсель, Франция.

Присутствие C.. burnetii определяли в образцах почек и селезенки 144 диких мелких млекопитающих, отловленных на территории садово-парковых зон Санкт-Петербурга в 2006-2007 гг, в органах (селезенка, почки) 25 лабораторных мышей линии C57BL, зараженных внутрибрюшинно живой вакциной «М-44», в крови больных с лихорадкой неясной этиологии. В качестве отрицательных образцов использовали ДНК Leptospira sp., Ureaplasma sp., Chlamydia sp. с содержанием геномов 1010/мл (ООО «Интерлабсервис», г. Москва), кровь здоровых доноров, кровь лабораторных интактных мышей и морских свинок.

Культивирование C. burnetii проводили в желточных мешках куриных эмбрионов общепринятым методом (Леннет Э., Шмидт Н., 1974), и в монослойной культуре клеток Vero (ATCC CRL 1587) с соблюдением правил работы с микроорганизмами 2 группы патогенности. Клетки С. burnetii очищали от тканевых примесей согласно Демкин В.В. и др. (1993). Для подсчета клеток C. burnetii в материале при помощи окулярной сетки использовали метод флуоресцирующих антител (Балаева Н.М., 1960). Методом последовательных разведений готовили растворы с концентрацией коксиелл 109 – 101 клеток/мл. Геномным эквивалентом (ГЭ) считали ДНК одной клетки C. burnetii (Willems H. et al., 1996).

Выделение тотальной ДНК из всех исследуемых образцов, включая культуры С. burnetii, проводили методом фенольной экстракции с использованием набора реагентов «Векто-ДНК-экстракция» (ЗАО «Вектор-Бест» г. Новосибирск).

Для амплификации ДНК C. burnetii методами ПЦР и ПЦР-РВ использовали ранее известные (Mossienko E., Tokarevich N., 2003; Raoult D., 2005; Glazunova O. et al., 2005; Klee S. et al., 2006), и сконструированные праймеры. Праймеры и зонд разрабатывали с помощью программ Epimer, Primer3, Vector NTI 8 на основе данных о нуклеотидной последовательности ДНК C. burnetii (NC 002971, NC 010117, NC 009726).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»