WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Введение клеток осуществляли 2 путями: интрамиокардиально и внутривенно. Среднее число клеток составляло 2x106. Интрамиокардиально клетки вводили в 0,4 мл ростовой среды -МЕМ через 10 минут после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта с помощью инсулинового шприца из 6 точек. Внутривенно клетки также вводили в 0,4 мл ростовой среды -МЕМ через 10 минут после коронароокклюзии в краевую вену уха через периферический катетер. Животным контрольной группы либо интрамиокардиально, либо внутривенно вводили только 0,4 мл ростовой среды -МЕМ.

Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде. Через 20 суток после трансплантации клеток трех кроликов из каждой группы выводили из эксперимента (такой срок определялся длительностью жизни флуорохрома). Сердце разрезали на 2 части (базальную и апикальную) таким образом, что плоскость разреза проходила на уровне лигатуры перпендикулярно длинной оси сердца. Апикальную часть сердца измельчали и подвергали ферментативной диссоциации смесью трипсин-коллагеназы (Sigma, США). Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием, наносили на предметное стекло и производили подсчет меченых клеток. Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Ахiosсор» (Zeiss, Германия).

Электрокардиография. Электрокардиография (ЭКГ) во всех группах животных выполнялась до операции (норма), через 3 суток, 7 суток, 30 суток после операции и перед выведением животного из эксперимента (1 год после операции). Использовали портативный одноканальный электрокардиограф ЭКГ-001 («Красногвардеец», Россия). Амплитуда устанавливалась на 20 мм, а скорость

лентопротяжного механизма – на 50 мм/с. Оценку ЭКГ проводили по второму стандартному отведению.

9

Ультразвуковое исследование сердца. Ультразвуковое эхокардиографическое исследование выполнено на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с использованием линейного датчика 13 МГц. В каждой группе животных эхокардиографическое исследование выполнялось до операции, через 14 суток и 1 год после операции по стандартной методике. Эхокардиография проводилась с обязательной параллельной регистрацией ЭКГ-сигнала. Из парастернального доступа по длинной оси левого желудочка (с контролем из этого же доступа по короткой оси левого желудочка) в режиме М-модального сканирования регистрировался конечно - диастолический размер левого желудочка. Систолическую функцию левого желудочка регистрировали с помощью 2D – сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях. Расчеты фракции выброса по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхокамер. Кровоток в аорте оценивали в режиме импульсно-волновой допплерографии.

Методика оценки перфузии миокарда. Оценка перфузии выполнялась методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). Использовался радиофармацевтический препарат (РФП) Myoview (Nycomed, Великобритания), меченый технецием-99m. РФП в дозе 30-50 МБк вводился в краевую вену уха через периферический катетер. Спустя 10-15 минут после инъекции выполнялась ОФЭКТ на двухдетекторной гамма-камере E.Cam. var (Siemens, Германия). Для количественной оценки уровня перфузии миокарда использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в патологической зоне к таковому в референтной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значения пикселя в патологической и референтной зонах.

Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда. Размер экспериментального инфаркта миокарда определяли с помощью окрашивания срезов сердца 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом (ТТХ). Методика окрашивания ТТХ позволяет на макроскопическом уровне отграничить необратимо поврежденную ткань миокарда от ткани, сохранившей жизнеспособность. У животных сразу после эвтаназии (через 12 месяцев после трансплантации клеток) извлекали сердце, промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины. Затем срезы помещали в 1% раствор ТТХ (ICN, США), окрашивающий жизнеспособный миокард с сохраненной активностью

10

НАД-зависимых ферментов в ярко-красный (кирпичный) цвет, и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°C и рН 7,4. Окрашенные срезы сердца фотографировали с базальной поверхности цифровой камерой Olimpus 2020. Компьютерную обработку изображений осуществляли с помощью программы Adobe Photoshop. Общую площадь рубца вычисляли по трем срезам и представляли в процентном отношении от площади среза. Методика измерения дилатации левого желудочка. Дилатацию левого желудочка оценивали по срезам сердца, окрашенным ТТХ. Сфотографированные срезы подвергали компьютерной обработке с помощью программы Adobe Photoshop. Дилатацию левого желудочка рассчитывали как отношение площади просвета левого желудочка к площади миокарда обоих желудочков. Полученный индекс дилатации (в отн. ед.) левого желудочка вычисляли по трем срезам и представляли среднее значение. Гистологическое исследование. После эвтаназии сердце кролика ниже лигатуры разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины – апикальный, средний, базальный. Затем срезы помещали в 10% раствор формалина на 4 суток. После фиксации каждый сегмент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по общепринятой методике. Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори, позволяющему выявить различные виды соединительной ткани. При этом коллагеновые волокна приобретали окраску разной интенсивности: от голубой до синей. Препараты исследовали на микроскопе «Биолам» (Россия). Количественная оценка васкуляризации. Оценивалась пограничная с рубцом зона. В каждом препарате в пяти последовательных полях зрения при увеличении х400 (окраска по Маллори) производился подсчет количества всех сосудов: артериол, капилляров, венул, вен и синусов. Статистическая обработка. Для статистической обработки данных использовалась статистическая программа SPSS. При небольшом числе наблюдений достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Все данные представляли в виде “среднее ± стандартное отклонение” и значение р менее 0,05 рассматривали в качестве значимого.

11

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнение способов получения ЯСК. Результаты сравнения резекционного и пункционного способов получения ЯСК представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Сравнение способов получения ядросодержащих клеток костного мозга.

Признак

Резекционный способ

Пункционный способ

Количество выделенных ЯСК (106/мл)

6,7±1,8

32±4,6

Цитохимическая реакция на ЩФ в культуре МСК

+

--

Время, затраченное на выделение ЯСК (мин)

150±15

60±15

Инвазивность процедуры

++++

+

Из представленных данных видно, что пункционный способ получения ЯСК по всем признакам имеет преимущество перед резекционным способом. В связи с этим ЯСК, полученные резекционным способом, в работе не использовались. Характеристика клеток костного мозга. В результате фракционирования эксфузата костного мозга на градиенте Перколла были выделены ЯСК. После подсчета и определения жизнеспособности клетки переносили в культуральную чашку диаметром 10 см2. В ходе культивирования было показано, что начиная с 3-4 суток появлялись единичные адгезивные клетки, имеющие вытянутую форму. На 7-8 сутки адгезивные клетки формировали колонии, представленные клетками с разными морфологическими свойствами: округлые, полигональные и веретиновидные. К 12-14 суткам адгезивные клетки формировали монослой, покрывая всё дно культуральной чашки. Морфологически культура становилась более гомогенной и, в основном, была представлена вытянутыми фибробластоподобными клетками. После пересева клетки вновь культивировали до образования монослоя. На 2 пассаже мезенхимальные стромальные клетки костного мозга представляли собой гетерогенную популяцию, но в основном имели веретеновидную форму. После ферментативной обработки и перевода клеток в суспензионное состояние их размер составлял в среднем 15-20 мкм. Общее количество клеток, полученное в ходе

12

культивирования, составляло 2x106. В ходе культивирования на каждом пассаже делался отсев для проведения цитохимических реакций (на ЩФ для выявление клеток остеогенного ряда и на нейтральные липиды для выявления клеток адипоцитарного ряда). В качестве контроля использовали культуры МСК, дифференцированные в остеогенном и адипоцитарном направлениях. Для индукции дифференцировки в остеогенном направлении использовали среду -МЕМ с добавлением -глицерофосфата натрия (10 мМ; Sigma, США), дексаметазона (100 нМ; Sigma, США) и аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл); для индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении использовали среду -МЕМ с добавлением дексаметазона (10 нМ), аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и ITS + LA-BSA (инсулин, трансферрин, селеновая кислота линейная алкилбензосульфоновая кислота). Результаты цитохимических реакций показали, что культура МСК характеризовалась отсутствием спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки. В то же время, проведенные исследования по стимуляции дифференцировки культуры МСК в остеогенном и адипоцитарном направлениях под действием индукторов указывали на их мультипотентность. Течение инфаркта миокарда. После лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии развивался инфаркт миокарда, который имел закономерное течение и сопровождался характерными патоморфологическими изменениями. На 4-е сутки после коронароокклюзии наблюдался некроз кардиомиоцитов с полным разрушением ядер, ограничением зоны некроза выраженным лейкоцитарным валом. На 14-е сутки отмечалась постепенная элиминация лейкоцитарной инфильтрации, в умеренном количестве визуализировалась незрелая соединительная ткань с небольшим количеством фибробластов. На 21-е сутки визуализировались единичные некротизированные кардиомиоциты, гистологически определялся сформировавшийся рубец с большим количеством фибробластов и коллагена. На сроке 1 год определялся рубец, образованный зрелой фиброзной тканью с большим количеством фибробластов и коллагеновых волокон. Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде. После интрамиокардиальной трансплантации культуры меченых МСК и ЯСК указанные клетки через 20 суток определялись в миокарде. Среднее количество меченых МСК, выявленных в диссоциированном миокарде, составило 9±3%, меченых ЯСК - 13±2% от общего числа трансплантированных клеток. После внутривенного введения флуоресцентно окрашенные МСК и ЯСК не идентифицировались в миокарде.

13

Электрокардиография. Во всех группах после коронароокклюзии развивались электрокардиографические признаки острого инфаркта миокарда, которые имели отчетливую закономерную динамику. Однако в контрольных группах и в группе животных, которым выполняли интрамиокардиальную трансплантацию ЯСК, регистрировались признаки трансмурального инфаркта миокарда. Тогда как в группе животных, которым интрамиокардиально трансплантировали культуру МСК, ЭКГ-данные указывали на развитие субэндокардиального инфаркта миокарда. Кроме того, в контрольных группах и в группе животных после интрамиокардиальной трансплантации ЯСК предсердные экстрасистолы возникали значительно чаще (78±10% и 74±7% на 3-и сутки, 19±8% и 24±6% на 7-е сутки после операции), чем в группе животных, которым выполняли интрамиокардиальную трансплантацию культуры МСК (9±3% на 3-и сутки и 8±4% на 7-е сутки после операции). По данным электрокардиографии после внутривенного введения клеток костного мозга разницы в течении инфаркта миокарда по сравнению с контролем выявлено не было. Нарушения ритма развивались примерно с одинаковой частотой во всех группах. Ультразвуковое исследование сердца. По данным УЗИ сердца в динамике проанализированы показатели систолической функции сердца: фракция выброса (ФВ), размер левого желудочка в диастолу (конечно-диастолический размер - КДР) и скорость кровотока через аортальный клапан (VAo). Динамика изменений показателей систолической функции сердца представлена в табл. 2 и 3.

Анализ эхокардиографических показателей систолической функции левого желудочка выявил выраженное положительное влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации МСК, проявляющееся в нормализации всех показателей через 1 год после операции. В то время как у животных после интрамиокардиальной аутотрансплантации ЯСК, наоборот, выявлялось резкое снижение показателей систолической функции левого желудочка по сравнению с контрольной группой. После внутривенного введения МСК и ЯСК различий между контрольной и опытными группами выявлено не было.

14

Таблица 2.

Показатели систолической функции сердца в контрольной и опытных группах после интрамиокардиальной трансплантации.

Показатель

показатель

Величина показателя (М±m)

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»