WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

МАТЮКОВ

Андрей Александрович

ВЛИЯНИЕ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА НА ТЕЧЕНИЕ ИНФАРКТА МИОКАРДА

(экспериментальное исследование)

14.00.16 – патологическая физиология

14.00.44 – сердечно-сосудистая хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Власов Тимур Дмитриевич

доктор медицинских наук, профессор Гриценко Владимир Викторович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Николаев Валентин Иванович (ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»)

доктор медицинских наук, профессор Хубулава Геннадий Григорьевич (Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «21» сентября 2007 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.090.03 Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (197089, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «___» августа 2007 г.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Несмотря на значительные успехи современной медицины, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему остаются главной причиной смертности и инвалидизации населения (Беленков Ю.Н. с соавт., 2003; Шахов В.П., Попов С.В., 2004). Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда. У человека на поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты утрачивают способность к регенерации. В результате этого погибшие в ходе ишемии кардиомиоциты замещаются соединительной тканью (Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998). Необратимое повреждение кардиомиоцитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности (Gaudron P. et al., 1993). Используемые в настоящее время консервативные и оперативные методы лечения ишемии миокарда не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин. Так, например, у больных с дистальным поражением и диффузными изменениями в коронарных артериях достичь реваскуляризации миокарда с помощью методов хирургической коррекции становится невозможным (Бокерия Л.А. с соавт., 2004). В связи с этим разрабатываются новые способы регенерации пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии (Репин В.С., 1998; Потапов И.В. с соавт., 2001; Шевченко Ю.Л., 2006). Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирургии является использование клеток костного мозга. Данный подход основан на способности клеток костного мозга участвовать в регенерации поврежденного миокарда (Шахов В.П., Попов С.В., 2004; Chachques J.S. et al., 2005). В терапии инфаркта миокарда используют различные клетки костного мозга: гемопоэтические стволовые клетки (Limbourg F.P. et al., 2005), эндотелиальные прогениторные клетки (Каtritsis D.G., 2005), мезенхимальные стромальные клетки (Tang Y.L., 2005), нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (Zhang S., 2004). Применяется как аллогенная, так и аутологичная трансплантация клеток, причем наиболее перспективным считается трансплантация аутологичных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии и отсутствием этических и юридических проблем. Наибольшую популярность получила аутотрансплантация мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга. Растущее число экспериментальных работ демонстрирует

4

положительный эффект трансплантации этих клеток на регенерацию поврежденного миокарда (Aceves J.L. et al., 2005; Piao H. et al., 2005; Gao L.R. et al., 2006; Krausgrill B. et al., 2006; Meluzin J. et al., 2006). Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования. Такими являются вопрос о наиболее эффективном типе клеток и вопрос об оптимальном способе введения клеток для восстановления миокарда.

Цель исследования.

Изучить влияние аутотрансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение острого инфаркта миокарда в эксперименте.

Задачи исследования.

  1. Отработать оптимальный способ получения клеток костного мозга кролика для последующей аутотрансплантации.
  2. Определить местонахождение трансплантированных клеток в миокарде при различных путях введения.
  3. Сравнить эффективность трансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда у кролика.
  4. Оценить влияние трансплантации различных клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда на различных сроках.
  5. Изучить эффективность различных путей введения клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда.

Научная новизна.

Впервые выполнено сравнение различных способов получения клеток костного мозга. Впервые на одной модели произведено сравнение влияния трансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга при разных путях введения на течение инфаркта миокарда у кролика.

Впервые проведена комплексная оценка морфофункционального состояния миокарда после трансплантации различных клеток костного мозга на основе использования современных инструментальных методов обследования (эхокардиографии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии).

5

Впервые охарактеризовано состояние миокарда в отдаленные сроки (1 год) после трансплантации клеток костного мозга.

Получены новые данные о возможности использования витального флуоресцентного красителя для идентификации трансплантированных клеток в миокарде кролика. Разработаны параметры оценки перфузии миокарда кролика методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии.

Теоретическая и практическая значимость.

Данные, полученные в исследовании, являются теоретической основой для внедрения клеточных технологий в клиническую практику, так как обосновывают оптимальный вид клеток костного мозга и их способ введения при лечении больных с инфарктом миокарда.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Клетки костного мозга, трансплантированные интрамиокардиально, сохраняются в зоне введения в течение нескольких недель.
  2. Введение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга оказывает выраженное положительное влияние на морфофункциональное состояние миокарда в разные сроки наблюдения после коронароокклюзии.
  3. Применение нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга приводит к увеличению размера зоны повреждения и ухудшению функционального состояния миокарда при экспериментальном инфаркте у кроликов.
  4. Внутривенное введение клеток костного мозга не изменяет течение экспериментального инфаркта миокарда у кроликов.

Реализация работы.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и госпитальной хирургии №2 Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. Подана заявка №20006124343 (06.07.2006) на изобретение: «Способ лечения больных пороками клапанов сердца» (соавт. Давыденко В.В., Гриценко В.В.), на которую получено положительное решение (20.06.2007).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки,

6

регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004; одиннадцатой межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005; юбилейной студенческой научной конференции, посвященной 100-летию клинической больницы Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии и 80-летию Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии «Студенческая наука – 2005», Санкт-Петербург, 2005; конкурсе бизнес-идей и научно-исследовательских разработок «Молодые. Дерзкие. Перспективные», Санкт-Петербург, 2005; научной конференции «Новые технологии в ядерной медицине», Санкт-Петербург, 2006; Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2006; двенадцатом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 2006; Невском радиологическом форуме «Новые горизонты», Санкт-Петербург, 2007.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 40 отечественных и 130 иностранных источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 50 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на кроликах-самцах линии Шиншилла массой 2,7-3,0 кг. Общее количество животных составило 98.

Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга. В работе использовали нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (ЯСК) и культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК).

Получение ядросодержащих клеток костного мозга. ЯСК получали двумя способами: резекционным и пункционным. При резекционном способе ЯСК выделяли путем ферментативной диссоциации костномозговой взвеси, полученной в ходе механической обработки резецированных фрагментов подвздошных костей. При пункционном способе выполняли пункцию крыла подвздошной кости, получали 10 мл эксфузата костного мозга, который фракционировали с помощью центрифугирования (1600 g, 20 мин) в градиенте плотности

7

Перколла (63%). Образовавшееся интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками промывали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+ (Gibco, США) и осаждали центрифугированием.

Получение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. Культуру МСК получали путем культивирования ЯСК, выделенных резекционным и пункционным путем. Культивирование ЯСК проводили в среде -МЕМ (IСN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл; Invitrogen, Великобритания) в СО2-инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа в течение 3 недель. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл; ICN, США). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи раствора трипсина (0,25%; Gibco, США) и ЭДТА (0,02% этилендиаминтетрауксусная кислота, Gibco, США).

Характеристика культур МСК. Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат с нитросиним тетразолем, Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и смесью суданов III и IV (BDH, Великобритания) для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.

Окрашивание клеток. Перед трансплантацией клетки костного мозга окрашивали ядерным флуоресцентным красителем Hoechst (Sigma, США). Для этого перед трансплантацией в клеточную суспензию добавляли флуорохром в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 60 минут в СО2-инкубаторе на шейкере. Из суспензии клеток готовили препараты и изучали на флуоресцентном микроскопе. При этом ядра клеток светились ярко-голубым цветом.

Подсчет клеток в суспензии и определение их жизнеспособности. Подсчет клеток костного мозга проводили в камере Горяева, а жизнеспособность определяли с помощью окраски трипановым синим (Лабтех, Россия).

Моделирование инфаркта миокарда. Всем животным инфаркт миокарда воспроизводился лигированием левой коронарной артерии (Horner et al., 1980; Ytrehus et al., 1994; Zhu et al., 2000). В условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом выполняли левостороннюю торакотомию в четвертом межреберье и перевязывали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца. Интраоперационная летальность составляла 10%, послеоперационная - менее 2%.

8

Введение клеток животным. Все животные были разделены на 7 групп:

1-ая группа – интрамиокардиальное введение ростовой среды -МЕМ (модифицированная среда Игла; контроль, n = 13);

2-ая группа – интрамиокардиальная аутотрансплантация культуры МСК (n = 18);

3-я группа – интрамиокардиальная аутотрансплантация ЯСК (n = 18);

4-ая группа – внутривенное введение ростовой среды -МЕМ (контроль, n = 11);

5-ая группа – внутривенное введение культуры МСК (n = 15);

6- ая группа - внутривенное введение ЯСК (n = 18);

7 –ая группа – неоперированные животные (n = 5).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»