WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Животных тщательно осматривали с целью обнаружения кожных поражений. У всех животных забирали кровь для изготовления препаратов-мазков. Забой животных производили декапитацией после анестезии ингаляцией эфира. Погибших или забитых в ходе опытов животных подвергали анатомическому исследованию. Все подозрительные на опухолевое поражение участки тканей вырезали и фиксировали в 12% формалине. Легкие животных исследовались на наличие гельминтов. Помимо этого, у части животных проведено цитологическое исследование внутренних органов (почки, печень, селезенка, костный мозг, гонады) на препаратах – отпечатках, фиксированных и окрашенных гематологическими методами. Для микроядерного анализа использовали цитологические мазки костного мозга, пульпы селезенки и паренхимы печени, фиксированные 96% этанолом. На протяжении большей части года и особенно весной в большинстве органов (печень, гонады, костный мозг) земноводных митотическая активность очень мала. Методика стимуляции пролиферации в гепатоцитах путем резекции печени дает очень непостоянные результаты. В связи с этим, для исследования повреждений в метафазных хромосомах изготовляли препараты из селезенки, где имеется относительно большое количество делящихся клеток в весеннее время года. После аккуратного измельчения селезенки с помощью глазных ножниц спленоциты освобождались от стромы путем промывания и пропускания через иглы шприцов уменьшающегося диаметра и использовались для приготовления препаратов метафазных хромосом.

Морфологические методы

Из фиксированного материала после заливки в парафин изготовляли гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и гематоксилином-пикрофуксином по Ван-Гизон. При обнаружении паразитов в легочной ткани из нее изготовляли тотальные пленочные препараты (которые из-за анатомических особенностей легких у земноводных более удобны для изучения, чем срезы), фиксировали спирт-формолом по Шафферу и окрашивали эритрозин-метиленовым синим. Для цитологических препаратов внутренних органов, препаратов-мазков для микроядерного анализа применяли окрашивание по Романовскому-Гимзе или эритрозин-метиленовым синим по оригинальной методике (Манских В.Н., 1999). На цитологических препаратах производили оценку количества лимфоидных клеток и макрофагов в печени и костном мозге, а также оценивали долю макрофагов и гибнущих клеток в селезенке с исключением из подсчета тромбоцитов, зрелых эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов. Клетки, гибнущие по механизму апоптоза, выявляли по морфологическим критериям (кариопикноз, кариорексис, маргинация хроматина и распад клетки на апоптозные тельца) на тех же препаратах. Учитывая, что лимфоциты в препаратах печени могут принадлежать как ткани органа, так и попадать из крови, подсчет производили в стандартизованных полях зрения, содержащих не менее 3 и не более 10 гепатоцитов и не менее 5 и не более 15 эритроцитов (окуляр х10; объектив х90). Полученный результат выражали в процентах от общего числа макрофагов, лимфоцитов и гепатоцитов. В костном мозге подсчитывали процентное содержание лимфоидных клеток и макрофагов от числа всех миелокариоцитов. Во всех случаях просматривали не менее 2000 клеток.

Индукция мутагенеза канцерогенными агентами

В качестве бластомогенного агента использовали метилнитрозомочевину (МНМ), канцерогенная активность которого в отношении бесхвостых амфибий показана рядом авторов (Худолей В.В., 1999). Для исследования были использованы только половозрелые самцы. Все животные в каждом исследовании были разделены на опытные (N=9) и контрольные (N=7) группы (всего 74 лягушки и 60 жаб). Канцероген вводили в полость тела в дозе 25 мг/100г. массы в 0,64%-ом растворе хлорида натрия по схеме, предложенной для изучения мутагенеза у млекопитающих М. Carriott и соавт.: 2 инъекции с интервалом в 1 сутки и забой животных ингаляцией эфира через 24ч. после последнего введения. Условия содержания и время суток, в которое производили введение мутагена и забой животных, во всех случаях были идентичны (5-7 ч. вечера).

Динамику элиминации аберрантных клеток оценивали после введения по аналогичной методике производного метилнитрозомочевины – алкилирующего агента ломустина в дозе общей дозе 4мг/100г.массы (в 10% растворе этилового спирта на 0,64% NaCl). Материал для исследования (спленоциты) забирали через 1, 4, и 14 суток после последней инъекции мутагена.

Цитогенетические методы

Мутагенез оценивали микроядерным тестом, для которого показана возможность применения на бесхвостых амфибиях (Войтович А.М, Елисеева К.Г., 1989; Ильинских Н.Н. И соавт., 1992; Yin X.H. et al., 2009). Микроядерный тест является стандартной процедурой регистрации клеток с повреждениями генома, основанный на выявлении микроядер в интерфазных клетках, которые, как считается, образуются из отставших в митозе целых хромосом или их ацентрических фрагментов (Sato S.

et al., 1995; Dass S.B. et al., 1997; Hayes J. et al., 2009). Микроядра и фигуры митозов подсчитывали с иммерсией на 2000 клеток с исключением из подсчета дефектных полей зрения и зрелых форменных элементов крови, полученные результаты выражали в промилле. Регистрировали патологические формы кариокинеза. Исследовались также повреждения в метафазных хромосомах делящихся спленоцитов. Поскольку приведенные в литературе указания относительно приготовления препаратов хромосом амфибий (сроки гипотонии, состав гипотонической среды, время колхицинизации, доза колхицина и т.д.), как показал наш опыт, не дают удовлетворительных результатов, нами были разработана собственная модификация этой методики. В брюшную полость животного на 5 часов вводится 0,5мл 0,1% раствора колхицина в дистиллированной воде для накопления клеток в стадии метафазы митоза. Длительная, 7 часов и более, колхицинизация нецелесообразна, так как приводит к резкой конденсации хромосом и делает невозможным цитогенетический анализ. Выделенные по описанной выше методике спленоциты заливаются дистиллированной водой (5 мл) на 2 часа при комнатной температуре. Менее жесткая гипотония не дает достаточного разброса хромосом на метафазных пластинках. По прошествии этого времени клетки центрифугировали (5 мин. при 2000 об./мин.), супернатант удаляли а осадок для фиксации ресуспензировали в 6 мл охлажденной до -4С смеси 96% этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) (приготовленной ex tempore) и инкубировали при этой температуре в течении 2 часов. Общепринятая двукратная смена фиксатора, по нашему опыту, не улучшает качество препаратов. После повторного центрифугирования и удаления супернатанта осадок ресуспензировали в 1 мл свежей фиксирующей смеси. Полученную взвесь по каплям наносили на мокрые, тщательно очищенные и охлажденные предметные стекла, высушивали методом поджигания и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Из-за низкого митотического индекса приходилось суммарно учитывать все подсчитанные метафазы в группе (не менее 200 пластинок в каждой группе на каждый срок).

Статистические методы

Результаты (представленные в виде М±SD) обрабатывали с использованием стандартного пакета программ «Statistica for Windows» с использованием t-критерия Стьюдента, критерия 2 и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфология и частота новообразований у бесхвостых амфибий и их морфологическая характеристика

У исследованных животных довольно часто встречались разнообразные образования на коже в виде язв, утолщений и аномальной пигментации. Аномальная пигментация была обусловлена гиперплазией меланоцитов в виде очагов в дерме и эпидермисе. Язвы имели, как правило, инфекционно-воспалительную природу. Утолщения были вызваны главным образом кровоизлияниями в толщу кожи. В двух случаях сильно утолщенных конечностей у серых жаб гистологически обнаружено образование костной мозоли. Лишь три раза нам встретились истинные опухоли кожи: аденома кожных желез у остромордой лягушки, ранее неоднократно описанная многими авторами и две другие опухоли, диагностированные как пигментированные фибропапилломы, найденные нами впервые. Таким образом, все три найденные нами опухоли кожи имели доброкачественный характер.

Кроме опухолей кожи, нам удалось найти также 2 случая опухолей системы крови и один случай опухолевого поражения легких. Неоплазмы крови были представлены хроническим миелолейкозом у лягушки и эритромиелозом у серой жабы. В литературе отсутствуют описания случаев спонтанных и экспериментальных лейкозов миелоидного происхождения у амфибий. В обоих представленных случаях найдены в значительном числе недифференцированные клетки эритроидного (у серой жабы) и гранулоцитарного нейтрофильного (у остромордой лягушки) ростков кроветворения с соответствующими цитологическими и гистологическими изменениями в кроветворных органах, вполне соответствующих признакам лейкозов у других позвоночных (Dawe C.J, 1969, Гольдберг Е.Д., 1989). Отличием от других позвоночных животных служит интенсивная пролиферация гемопоэтических клеток в периферической крови, что, очевидно, может быть связано с особенностями кроветворения у амфибий, в частности, с возможностью выхода в кровоток единичных пролиферирующих клеток в физиологических условиях в весеннее время года.

Еще в одном случае были обнаружены разрастания опухолевой ткани на поверхности обоих легких. Гистологически опухоль может быть определена как низкодифференцированная полиморфноклеточная саркома. Учитывая характер роста опухоли (в виде солидных очагов или муфт вокруг сосудов), гистологическое строение (крупные полигональные клетки), прорастание опухолью лишь периферических отделов легкого мы полагаем, что данная опухоль является саркоматозной мезотелиомой с гематогенными метастазами в печень и почки.

Распространение опухоли на оба легких в виде множественных очагов, по-видимому, произошло имплантационным путем.

Необходимо сказать несколько слов о других исследованных нами животных. При анатомическом исследовании в нескольких случаях найдены опухолевидные образования в печени и на стенке пищеварительного тракта, микроскопически оказавшиеся инкапсулированными паразитами. Истинные опухоли других органов не отмечены.

Общая частота опухолей в исследованной нами выборке у лягушек составила 0,72%, тогда как у жаб Bufo bufo опухоли были найдены у 0,98% животных. Однако, такое сравнение некорректно, и адекватным является сравнение частот неоплазм злокачественного характера. У лягушек они были обнаружены у 0,48% животных, у жаб – 0,32% (доброкачественные – 0,24 и 0,64% соответственно). Несмотря на небольшой объем выборки, все выявленные различия оказались достоверными (p=0,0000), т.е. у жаб доброкачественные опухоли встречались чаще, а злокачественные – реже, чем у лягушек (рис.1).

Существует несколько работ, посвященных изучению частот спонтанных опухолей у бесхвостых амфибий, проведенных в 80-х годах в Эстонии (Г.Т.Кобзарь и С.А.Карлова (1984), на Rana temporaria и Bufo bufo) и Ленинградской области (В.В.Елисеев и В.В.Худолей (1981), на Rana temporaria и Rana ridibunda), данные которых можно сопоставить с нашими. Это сопоставление показывает значительно большую поражаемость опухолями жаб в популяции, обитающей в Кемеровской области по сравнению с эстонской популяцией, при исследовании несколько большей выборки вообще не удалось обнаружить опухолей у этих животных (Кобзарь Г.Т., Карлова С.А.,1984). Очевидно, это связано со значительно более неблагоприятными экологическими условиями на территории Кемеровской области. Более низкая частота новообразований у исследованных нами лягушек по сравнению с ленинградской популяцией (0,72 и 2,5%

Рис. 1. Частоты опухолей в исследованных выборках жаб (Bufo bufo) и лягушек (Rana arvalis и Rana ridibunda).

соответственно),быть может, отчасти обусловлена небольшими размерами сравниваемых выборок или может быть обусловлена генетическими особенностями исследованных популяций. Кроме того, в работе В.В.Елисеева и В.В.Худолея (1980) речь шла исключительно о доброкачественных новообразованиях, тогда как нами обнаружены и злокачественные опухоли. Таким образом, в ленинградской популяции R.ridibunda и R.temporaria наблюдалась только более высокая частота доброкачественных аденом, но не злокачественных опухолей. В работе Г.Т.Кобзаря и С.А.Карловой (1984) у эстонских лягушек были найдены не только аденомы, но и злокачественные аденокарциномы, однако, частоту их авторы не сообщают. По-видимому, частое образование доброкачественных аденом кожи (но не истинных злокачественных неоплазм) можно считать видовой особенностью Rana temporaria и Rana ridibunda.

Морфологические изменения клеток печени и костном мозге при действии МНМ

Морфологические изменения клеток печени жаб и лягушек при действии МНМ были в общем сходными и соответствовали состоянию гиперфункции этого органа. У значительного числа клеток отмечено значительное увеличение размеров клеток и базофилии цитоплазмы (при окраске по Гимзе) с образованием светлого «дворика» возле ядра. Ядра таких клеток крупные, гиперхромные, с мелкозернистым хроматином и неправильными контурами. Среди таких клеток нередко отмечались фигуры митотического деления, некоторые клетки содержали микроядра. Указанные изменения были выражены в разных клетках в неодинаковой степени, что свидетельствует о функциональной гетерогенности популяции гепатоцитов амфибий. Встречались и гибнущие клетки с пикнотическими ядрами. Интересной особенностью печени подопытных жаб является присутствие большого количества лимфоидных клеток, среди которых часто (до 0,5%) встречаются фигуры митозов. Необходимо также отметить большой полиморфизм ядер этих клеток. Характерно, что количество лимфоцитов в печени у жаб достоверно выросло по сравнению с контролем (от 9,0±3,6% до 14,4±1,6%; p=0,0019); у лягушек таких изменений не выявлено. Не наблюдалось и достоверных изменений в числе макрофагов в печени у лягушек. У жаб, напротив, этот показатель достоверно возрос (от 0,65±0,65% до 6,8±3,6%; p=0,0032). Интересно, что, несмотря на отсутствие достоверных отличий от контроля, в опытных группах у лягушек выявлена статистически значимая высокая корреляция между содержанием макрофагов в печени и митотическим индексом в гепатоцитах (r = +0,81; p=0,03). Не исключено, что макрофаги в этом случае могут выступать как регуляторы пролиферации печеночных клеток. Морфологические изменения в костном мозге амфибий при введении МНМ заключались лишь в более выраженной гибели полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов, особенно у лягушек.

Митотическиая активность и частота цитогенетических аберраций (микроядерный тест) в соматических клетках бесхвостых амфибий при введении МНМ

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»