WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |

18

Абсцесс печени 6

+

+

+

19

Абсцесс мышц

+

+

20

Биоматериал отмыши

+

+

+

21

Некротич. очаг от мыши

+

+

22

F. necroph. изколлекции

+

+

+

23

F. necrophorum лиофилизиров. 1

+

н/и

+

24

F. necrophorum лиофилизиров.2

+

н/и

+

25

F. necrophorum.

+

+

+

Примечание: “+ ” положительный результат,

“ ”отрицательный результат

Разработаннаядиагностическая тест-система полимеразнойцепной реакции с гнездовыми праймерамиобладает строгой специфичностью ипозволяет выявлять в биологическихобразцах патогенный биотип АВ F.necrophorum subsp. necrophorum.

Диагностическоеисследование биологических образцов изпораженных конечностей на некробактериозбактериологическим методом и полимеразнойцепной реакцией тождественно.

ПЦР с гнездовымипраймерами для выявления F. necrophorum subsp.necrophorum может бытьиспользована в качестве экспресс-методадля диагностики кожной формынекробактериоза.

2.2.3 Определение ролиспецифической профилактики в системеконтроля эпизоотического процессанекробактериоза крупного рогатогоскота.

2.2.3.1 Регламентполучения антигена Fusobacteriumnecrophorum и
постановка реакцииагглютинации

В настоящее время нетединого антигена для обнаружения антителпротив возбудителя некробактериоза F. necrophorum. Каждыйисследователь готовит собственный антиген(АГ) для РА на основе полученныхизолятов. В доступной отечественнойлитературе мы не встретили работ,сообщающих о методике изготовленияантигена F. necrophorum для РА, утвержденной директивнымиорганами РФ. Ранее в своихисследованиях РА использовали ученыеВИЭВ (Я.Р. Коваленко, 1948, А.Р. Мусаев, 1993),НИИСХ Крайнего Севера (О.И. Соломаха, 1973).

Исходя из имеющихсясведений, мы поставили перед собойзадачу разработать регламентприготовления АГ F.necrophorum и методикупостановки РА.

2.2.3.1.1Выбор культуры (изолята) вкачестве антигена

Для исследования взяли10 культур F. necrophorum, выделенных от больныхнекробактериозом животных с разнойклинической формой.

Все культуры F. necrophorum хорошо рослина среде Китта-Тароцци илиаминокровин-сывороточном бульоне (АКСБ)при температуре 37С. Десять исследуемых культурвыделяли газы сероводород и индол, нерасщепляли углеводы.

Культура F.necrophorum “ИВ” вызывалаагглютинацию взвеси эритроцитов 5%-ойконцентрации в разведении 1:32. Культура“Тл” агглютинировала 5%-ую взвесьэритроцитов до разведения 1:16, культуры“Ор1”,“Bn2”, “Эл”,“В” только до разведения 1:4.Слабой агглютинирующей способностьюобладали культуры “Н”, “Ор2” до разведения1:2.

Вирулентные свойствакультур F.necrophorumизучали на белых мышах. По данным таблицы 2 можноотметить, что наиболее патогенным длямышей оказалась культура “ИВ” F.necrophorum.На месте инъекции культуры “ИВ” F. necrophorum у всех мышей образовался некрозтканей. Она вызвала гибель всех мышейчерез 57дней.

Культура F. necrophorum “Тл”,вызвала образование некроза на местеинъекции у всех животных в опытнойгруппе. Гибель мышей составила 66,7 % через78 дней вгруппе.

Таблица 2 – Результаты изучения патогенностикультур
F. necrophorum на мышах

Название культур F. necrophorum

Количество

мышей

Времяобразования некроза

(сутки)

Количество

павших,

гол./%

Время наступления летальногоисхода (сутки)

“Bn2

3

6

1/33,3

7

“Н”

3

6

0/0

“ИВ”

3

5

3/100

57

“Ор1”

3

8

0/0

“Ор2”

3

9

0/0

“Тл”

3

7

2/66,7

78

“Ол”

3

7

1/33,3

8

“Эл”

3

7

1/33,3

7

“Алт”

3

8

1/33,3

7

“В”

3

7

1/33,3

7

Контроль

3

-

-

-

Культуры “Bn2”,“Ол”, “Эл”, “Алт”, “В”также вызвали некроз тканей у всех мышей.Гибель животных составила 33,33% в каждойгруппе. Культуры “Н”, “Ор1”, “Ор2” вызвали некрозтканей на месте инъекции бактериальнойвзвеси, но все мыши оказалисьживыми.

В контрольной группеживотных на месте инъекциифизиологического раствора воспаления необнаружено, все мыши осталисьживыми.

Таким образом, по даннымреакции гемагглютинации и изучениявирулентных свойств культур F. necrophorum наиболеепатогенной для мышей оказалась культура“ИВ”. Культура F. necrophorum“ИВ” выделена из пораженнойконечности коровы. Летальная доза (LD50) Fusobacterium necrophorum “ИВ”для мышей составила 9,77 млн. микробныхклеток (9,77 ·107м.к.).На основании проведенныхисследований для приготовления антигенаотобрана культура Fusobacteriumnecrophorum “ИВ”, которая принятана депонированиеНаучно-исследовательским институтомКоллекции культур микроорганизмов (НИИККМ) Государственного научного центравирусологии и биотехнологии “Вектор”.

Принятая культураFusobacterium necrophorum “ИВ” в НИИ ККМ получила регистрационныйномер: B-845 (справка № 0100 от 18 сентября 2000 г.),и определяется нами как штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845.

Методика приготовленияантигена и постановки реакцииагглютинации выглядит в следующемвиде.

2.2.3.1.2 Методикаприготовления антигена F.necrophorum и техника
постановки РА

Культуру выращивалидвое суток на среде Китта-Тароцци, затемдля получения большого количествабактериальной массы Fusobacteriumnecrophorum ее пересевали наспециальную средуаминокровин-сывороточный бульон (АКСБ).Бактериальные клетки освобождали от средыпутем центрифугирования при 3000 об/мин втечение 20 мин, промывалифизиологическим раствором. Дляпредотвращения самоагглютинации АГ осадокклеток Fusobacteriumnecrophorum ресуспендировали вфосфатном буфере рН 7,6 доконцентрации 10 млрд. микробных клеток в1 мл по оптическому стандарту. Исследуемыепробы сыворотки крови животных такжеразводили в фосфатном буфере.

Антиген инактивировали0,4%-ым раствором формалина. Стерильностьантигена определяли путем посева на средыКитта-Тароцци, МПА, МПБ.

Основные этапыпостановки реакции агглютинацииследующие: 1.Готовили основное разведение каждойиспытуемой сыворотки крови; 2. Готовили рабочиеразведения каждой пробы сыворотки; 3. На следующем этапеработы во все пробирки с разведеннымисыворотками вносили антиген. Дляконтроля антигена с целью исключениясамоагглютинации в 1 мл фосфатного буферадобавляли 0,1 мл антигена. Штатив спробирками помещали в термостат притемпературе 37°С на 1518 часов, а затем выдерживали прикомнатной температуре 23 часа, после чегоучитывали реакцию агглютинации визуальнои оценивали ее в крестах.

Показателиагглютинации в пробирках на четыре, три илидва креста характеризуются какположительная реакция. Последнееразведение сыворотки, в которомнаблюдается агглютинация с оценками надва, три или четыре креста, считали еетитром.

2.2.3.2 Изготовление иапробация вакцины ГОА ИЭВСиДВ

2.2.3.2.1 Определениеиммунизирующей дозы вакцины.

На основаниилабораторных исследований нами разработанрегламент изготовления вакцины наоснове штамма Fusobacteriumnecrophorum ИВ B-845, стимуляторарезистентности и адъюванта гидроокисиалюминия. Для определения иммунизирующейдозы вакцины сформировали семь группживотных: шесть опытных и однаконтрольная, в каждой группе было по 4коровы. Коровам опытных групп № 1, 3, 5вакцину вводили однократно, а № 2, 4, 6дважды с интервалом три недели. Дозавакцины для животных групп № 1 и 2 – 1 мл, № 2 и 4 3 мл, № 5 и 6 5 мл. Животные 7-ойгруппы (контроль) не были вакцинированы.Титры антител в пробах сыворотки кровиживотных определяли при помощиразработанной нами реакции агглютинации(табл. 3).

Таким образом, наосновании результатов этих исследований вкачестве иммунизирующей взята дозавакцины 3 мл, как более экономичная идостаточно иммуногенная.

Таблица 3– Титрыантител сыворотки крови коров,иммунизированных разными дозамивакцины

Группа,

кратность

введения

Доза

вак-цины

Титры антител(lg)

передопытом

через

14 дней

через

1,5 мес.

через

3 мес.

через

5мес.

через
6 мес.

I/1

1 мл

2,3±0,05

2,45±0,04

2,5±0,05

2,5±0,05

2,3±0,03

2,3±0,04

II/2

1 мл

2,3±0,06

2,5±0,07

3,0±0,03*

2,6±0,08**

2,45±0,05

2,3±0,02

III/1

3 мл

2,3±0,04

3,0±0,05*

3,0±0,04*

2,8±0,04*

2,5±0,07

2,3±0,02

IV/2

3 мл

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»