WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Культивирование фибробластов осуществлялось по методу Фрешни Р. (1989) в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). При пересевах или постановке эксперимента, через 10-14 дней после формирования монослоя клеток, фибробласты снимали с поверхности флаконов смесью версена с трипсином и переводили в суспензию. Методом центрифугирования отделяли супернатант от осадка и гомогенизировали последний в среде выделения для использования в последующих методиках. Количество и жизнеспособность клеток после формирования монослоя оценивали в камере Горяева в присутствии 0,1% раствора трипанового синего.

Методы определения активности лизосомальных ферментов

В гомогенатах клеток определяли активность лизосомального катепсина Д по методу Баррет А.Дж. и др. (1980) и -глюкозидазы по методу Patel и Tappel (1969), основанных на спектрофотометрическом изменении количества продуктов реакции, катализируемых данными ферментами.

Активность ферментов определяли по количеству расщепленных субстратов в гомогенатах клеток (лиофильно высушенного гемоглобина при определении катепсина Д и р-нитрофенильных производных гликозидов при определении -глюкози-дазы). Для определения общей активности ферментов к пробам добавляли неионогенный детергент тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1 %. О функциональной активности лизосом судили по процентному соотношению свободной и общей активностей.

Изучение интенсивности ПОЛ

Изучение интенсивности ПОЛ в клетках определяли по содержанию ТБК-зависимых продуктов по методу Стальной И.Д. (1977), основанному на реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в кислой среде при 80°С, с образованием окрашенного комплекса с максимумом поглощения при 532 нм.

Методы определения параметров редокс-системы глутатиона

В гомогенатах клеток определяли содержание восстановленного глутатиона (GSH) (по модифицированному методу Sedlak S., 1968), активность глутатионпероксидазы (GSH-per) (по методу Beutler, 1975) и активность глутатионредуктазы (GSH-red) (по методу Ferrone S. et al., 1970).

МТТ-тест оценки метаболической активности клеток

Влияние исследуемых соединений на метаболическую активность фибробластов определяли по методу Mealey K.L. et al. (2002). Метод основан на способности ферментов дыхательной цепи митохондрий (сукцинатдегидрогеназ) живых клеток восстанавливать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов, то есть жизнеспособность клеток.

Статистическая обработка результатов

Все первичные экспериментальные данные хранились и обрабатывались с использованием программы “Microsoft Excel 2007” и прикладной программы BIOSTAT. Статистическая достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллиса, Ньюмена Кейлса и ранговой корреляции Спирмена для уровня значимости 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние стероидных соединений на активность лизосомальных ферментов в фибробластах интактной кожи крыс

На первом этапе работы мы оценивали влияние стероидов на активность лизосомальных ферментов (катепсина Д и -глюкозидазы) фибробластов интактной кожи крыс. О функциональной активности лизосом судили по процентному соотношению свободной и общей активностей ферментов.

При изучении влияния стероидов на исследуемые параметры было обнаружено их неоднозначное действие. Гидрокортизон, после предварительной инкубации с суспензией клеток в течение 1 часа, концентрация-зависимо снижал как абсолютные значения свободной и общей активности обоих исследуемых ферментов, так и их соотношение, повышая, таким образом, прочность связывания ферментов с мембранами лизосом. При этом функциональная активность лизосом снижалась в основном за счет снижения значений свободной активности ферментов (в большей степени катепсина Д, в меньшей - -глюкозидазы). В максимально исследуемой концентрации (10-3М) гормон повышал прочность связывания катепсина Д с мембранами лизосом на 59%, -глюкозидазы – на 44%, что свидетельствует о высоком мембраностабилизирующем действии гидрокортизона. Аналогичное, но менее выраженное действие на лизосомы оказывал дексаметазон.

Прогестерон статистически значимо снижал выход исследуемых лизосомальных ферментов из мембран только в концентрации 10-3М (-глюкозидазы на 40%, катепсина Д – на 20%). При этом снижение доли свободной активности ферментов на 55% в этой концентрации, возможно, являлось следствием стабилизирующего воздействия гормона на липидный бислой лизосомальных мембран [Ухина Т.В., 2004], обнаруженный в ранее проведенных исследованиях.

В отличие от прогестерона, АБМП, в концентрации 10–7М через 1 час инкубации с клетками снижал в них свободную активность катепсина Д на 17,6%, практически не изменяя значения общей активности фермента. При этом соединение, наряду с глюкокортикоидами, повышало прочность связывания фермента с мембранами лизосом на 25%. В максимальной исследуемой концентрации (10-3М) АБМП доля свободной активности фермента снижалась на 70,6%, а процентное соотношение на 68,6%, что в 2,5 раза сильнее действия на клетки прогестерона в той же концентрации.

При изучении действия АБМП на -глюкозидазу было выявлено, что в концентрации 10-7М соединение практически не влияло на активность фермента, а в концентрации 10-5М, в отличие от прогестерона, увеличивало его активность. Последнее, предположительно, связано с активацией самого фермента, либо, что более вероятно, с химической структурой и метаболизмом стероидного соединения. Так, при воздействии АБМП в концентрации 10-5М в течение 1 часа свободная активность фермента повышалась приблизительно на 37%, что, вероятно, может быть связано с его мембранотропным действием. Увеличение концентрации гормона до 10-3М вызывало повышение свободной активности фермента вдвое по сравнению с контролем. Активность лизосом при этом характеризовалась повышением высвобождения фермента в связи со снижением прочности его связывания с мембранами лизосом на 30%.

Таким образом, все исследуемые гормоны концентрация-зависимо изменяли активность лизосомальных ферментов в фибробластах интактной кожи крыс. Глюкокортикоиды и прогестерон оказывали выраженное мембраностабилизирующее действие, выражающееся в способности повышать прочность связывания лизосомальных ферментов с мембранами лизосом, ограничивая тем самым выход из них ферментов и, в результате, повреждение клеток. Действие АБМП зависело как от времени инкубации с клетками, так и от вида фермента. АБМП, в отличие от исследуемых стероидов, начиная с концентрации 10-5М повышал свободную и общую активность -глюкозидазы, что может быть связано с химической структурой и метаболизмом самого стероидного соединения.

Влияние стероидных соединений на интенсивность ПОЛ в фибробластах интактной кожи крыс

Об уровне ПОЛ в клетках судили по содержанию ТБК-активных соединений - конечных продуктов ПОЛ. Спустя 30 минут инкубации с клетками глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон) уже в концентрации 10-7М статистически значимо снижали исследуемый параметр в клетках на 15%. По мере увеличения концентрации гормонов до 10-3М значения исследуемого параметра в клетках снижалось почти в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. Спустя 1 час после начала инкубации действие глюкокортикоидов усиливалось и вело к еще большему снижению содержания ТБК-активных соединений (на 20% в концентрации 10-7М и на 40% в концентрации 10-5М). В максимально исследуемой концентрации (10-3М) глюкокортикоиды снижали исследуемый параметр в 2 раза по сравнению с нормой.

Гестагены (прогестерон, АБМП), в отличие от глюкокортикоидов, спустя 30 минут инкубации с клетками вызывали статистически значимое снижение определяемого параметра (на 10-12%) только в концентрации 10-3М. По истечении 1 часа инкубации клеток с гормонами влияние гестагенов усиливалось, в концентрации 10-5М сопровождаясь снижением исследуемого параметра на 37-40% и в концентрации 10-3М - на 60-64%. АБМП снижал содержание ТБК-активных соединений более выражено, чем прогестерон и глюкокортикоиды.

Таким образом, все исследуемые стероиды снижали интенсивность процессов ПОЛ в фибробластах интактной кожи крыс, в зависимости от концентрации и сроков инкубации с клетками. Наибольшую антиокислительную активность проявляли гестагены в концентрации 10-3М, снижая содержание ТБК-активных соединений в клетках в 2 раза по сравнению с нормой. Эти свойства гестагенов могут способствовать нормализации окислительных процессов в коже при дерматозах с воспалительным компонентом (в том числе псориазе).

Влияние стероидных соединений на параметры редокс-системы глутатиона в фибробластах интактной кожи крыс

Далее оценивалось влияние исследуемых стероидов на компоненты антиоксидантной системы защиты, наибольшее значение из которых занимает редокс-система глутатиона. В связи с этим мы изучали содержание восстановленного глутатиона (GSH), активность глутатионредуктазы (GSH-red) и глутатионпероксидазы (GSH-per) без воздействия и при воздействии на них гормонов.

Спустя 1 час инкубации гидрокортизона с клетками значения всех исследуемых параметров статистически значимо повышались, начиная с концентрации 10-5 М. В максимальной исследуемой концентрации (10-3М) содержание GSH увеличивалось на 47%, а активность ферментов GSH-red и GSH-per редокс-системы глутатиона на 40% и 15% соответственно. Аналогичное, но менее выраженное действие на исследуемые параметры оказывал дексаметазон.

Прогестерон, в отличие от глюкокортикоидов, оказывал менее выраженное действие на параметры редокс-системы глутатиона. При этом, начиная с концентрации 10-5М, гормон в большей степени повышал активность фермента GSH-red (на 25%) практически не изменяя содержание GSH и активность GSH-per. АБМП действовал на ферменты редокс-системы глутатиона сравнимо с прогестероном и, наряду с глюкокортикоидами, выражено (в 2-3 раза по сравнению с прогестероном) увеличивал содержание GSH.

Таким образом, можно полагать, что антиокислительные свойства исследуемых стероидов могут быть связаны с их непосредственным влиянием на параметры редокс-системы глутатиона в фибробластах кожи. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что АБМП, наряду с глюкокортикоидами и в большей степени, чем прогестерон, обладает выраженными антиокислительными свойствами.

Метаболическая активность фибробластов интактной кожи крыс

Фибробласты инкубировали со стероидными соединениями в течение 2 и 5 суток. Максимально действующая концентрация - 10-5М, минимально действующая - 10-7М. О метаболической активности клеток судили по изменению количества жизнеспособных клеток в тесте. Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100%-ю выживаемость клеток.

При инкубации фибробластов с гормонами в течение 2-х суток, глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон) оказывали выраженное действие на клетки, подавляя их метаболическую активность на 30-40% практически равнозначно во всех концентрациях. В отличие от глюкокортикоидов, гестагены (прогестерон, АБМП) в малых концентрациях (10-7, 10-6М) не оказывали статистически значимых эффектов. При увеличении концентрации до 10-5М прогестерон, как и АБМП, вызывал снижение метаболической активности фибробластов на 25%.

По истечении 5 суток инкубации стероидов с клетками, гидрокортизон в концентрациях 10-7 и 10-6М вызывал подавление их метаболической активности на 22% и 30% соответственно, а в концентрации 10-5М - на 35%. Дексаметазон, начиная с концентрации 10-6М, оказывал максимальное антиметаболическое действие среди всех исследуемых гормонов, снижая жизнеспособность фибробластов на 40-50%. Действие прогестерона оставалось примерно на том же уровне. АБМП в концентрациях 10-7 и 10-6М подавлял метаболическую активность клеток приблизительно на 10-15%, а в концентрации 10-5М, подобно глюкокортикоидам, оказывал максимальное действие, выражающееся в подавлении метаболической активности клеток на 38%.

Анализ данных позволил определить ряды по эффективности подавления стероидами метаболической активности фибробластов интактной кожи крыс (Табл.1.).

Табл. 1. Ряды по эффективности подавления гормонами метаболической активности фибробластов интактной кожи крыс

Срок инкубации

Концентрация

2 суток

5 суток

10-7М

ДМ>ГКАБМППГ

ГКДМПГАБМП

10-6М

ДМГК>АБМППГ

ДМ ГК>ПГАБМП

10-5М

ГКДМ>ПГАБМП

ДМ>АБМПГКПГ

Примечание: ПГ – прогестерон, ГК – гидрокортизон, ДМ – дексаметазон, > – достоверное отличие между соединениями (р<0,001), – недостоверное отличие

Из таблицы видно, что по истечении 5 суток инкубации клеток со стероидами, гестаген АБМП в концентрации 10-5М, наряду с глюкокортикидами, оказывает выраженное антиметаболическое действие. Возможно, подавление метаболической активности клеток также косвенно указывает на антипролиферативное действие соединения.

Активность лизосомальных ферментов в фибробластах кожи человека при псориазе

В данной части работы мы оценивали исследуемые параметры в фибробластах, выделенных из биоптатов кожи больных псориазом мужчин и женщин разных возрастов, а затем полученные значения сравнивали со значениями нормы.

Биоптаты были взяты до лечения заболевания под местной анестезией из участков пораженной кожи туловища 30 больных (16 мужчин (53%) и 14 женщин (47%)) с вульгарной формой заболевания в стадии обострения. Наибольшее число больных приходилось на возраст от 25 до 40 лет: средний возраст составил 35 лет. Длительность заболевания колебалась от нескольких месяцев до 10 лет и более. В качестве контроля использовали биоптаты интактной кожи, полученные от 30 здоровых добровольцев (13 мужчин (43%) и 17 женщин (57%) в возрасте от 24 до 45 лет).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»