WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЛЕМСКАЯ НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА

КАРИОТИПИЧЕСКАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ARVICOLINAE

03.00.15 ГЕНЕТИКА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2008

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Изучение генома является одной из актуальных задач генетики. На основании данных по картированию геномов человека и других видов млекопитающих удалось показать, что синтенные группы генов в течение многих миллионов лет сохранились неизменными (Nash, O’Brien 1982).

C помощью методов классической цитогенетики были предложены первые предковые кариотипы для некоторых отрядов и для всего класса млекопитающих (Viegas-Pequignot et al. 1985; Dutrillaux, Couturier 1983; Graphodatsky 1989). Однако из-за внутрихромосомных перестроек многие районы синтении не выявляли видимой цитологической гомологии. Появление метода хромосомного пэйнтинга позволило избавиться от многих ограничений в сравнительных исследованиях. Метод основан на использовании наборов индивидуальных библиотек сортированных или микродиссектированных хромосом (пэйнтинг-проб) разных видов животных. Использование этих наборов в гетерологичной флуоресцентной гибридизации in situ (Zoo-FISH) явилось прорывом в цитогенетике млекопитающих, так как с его помощью стало возможным быстро и эффективно сравнивать геномы филогенетически далеких видов животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что в эволюции большинства таксонов млекопитающих не происходило перераспределения генетического материала между крупными консервативными районами, сохранившимися целиком у современных видов. Можно считать, что эти районы присутствовали и в кариотипе предка плацентарных млекопитающих (Murphy et al. 2001). В то же время в ряде таксонов (Canidae, Hylobatinae, Cricetidae-Muridae) высокая частота хромосомных перестроек приводила к массовой перетасовке предковых синтенных групп и быстрой реорганизации геномов (Графодатский 2001). Cкорость кариотипической эволюции не одинакова в разных таксонах млекопитающих. Практически каждый таксон млекопитающих характеризуется как определенным набором консервативных районов, так и специфическими перестройками между и внутри этих районов.

Настоящая работа посвящена изучению грызунов подсемейства полевковых Arvicolinae (полевки и лемминги) на основе использования метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. Подсемейство представляет значительный интерес межвидовыми контрастами базовых кариотипических характеристик: локализация и размеры блоков С-гетерохроматина, наличие добавочных хромосом, широкая вариабельность диплоидных чисел, нестандартная система определения пола у некоторых видов. Подсемейство Arvicolinae является весьма интересным объектом для исследования закономерностей хромосомной эволюции, так как объединяет виды, обладающие одними из самых перестроенных и быстро эволюционирующих геномов в классе млекопитающих (Ferguson-Smith 1997; Conroy, Cook 1999; Galewski et al. 2006). Кариотипы большинства представителей Arvicolinae описаны с помощью методов классической цитогенетики: рутинной и дифференциальных окрасок. Вследствие значительной перестроенности хромосом выявление гомологичных элементов в кариотипах некоторых видов часто оказывалось затруднительным без применения современных молекулярно-цитогенетических методов, таких как хромосомный пэйнтинг.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является исследование кариотипических взаимоотношений полевок подсемейства Arvicolinae.

Для достижения данной цели, были поставлены следующие задачи.

  1. Охарактеризовать кариотипы представителей подсемейства Arvicolinae с помощью пэйнтинг-проб пашенной полевки (M. agrestis).
  2. Сравнить хромосомы M. agrestis и копытного лемминга (D. torquatus) с помощью реципрокного пэйнтинга.
  3. Реконструировать предковые кариотипы для рода Microtus, рода Ellobius и для подсемейства Arvicolinae.
  4. Реконструировать вероятную последовательность преобразований, приведшую к формированию кариотипов современных видов полевковых.
  5. Оценить темпы кариотипической эволюции видов подсемейства Arvicolinae.

Положения, выносимые на защиту.

  1. При сравнении кариотипов видов подсемейства Arvicolinae истинную гомологию некоторых хромосом и хромосомных районов возможно установить только с привлечением сравнительного хромосомного пэйнтинга. Кариотипы современных видов сформированы на основе различных комбинаций гомологичных хромосомных элементов.
  2. Сравнение консервативных элементов в геномах видов подсемейства Arvicolinae и видов из аутгруппы дает возможность реконструировать гипотетический предковый кариотип этого подсемейства и построить схему, отражающую возможный ход кариотипических преобразований, приведших к формированию современных видов.
  3. Темпы эволюции кариотипов в подсемействе Arvicolinae неодинаковы в разных филогенетических ветвях и в среднем значительно выше, чем во многих других таксонах млекопитающих.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые проведено GTG-окрашивание M. dogramacii и L. brandtii. Полученные данные использованы для сравнения этих видов с другими представителями полевковых Arvicolinae.

Впервые проведена гомологичная гибридизация in situ набора сортированных хромосом M. agrestis, что позволило охарактеризовать этот набор пэйнтинг-проб и эффективно использовать его в исследовании кариотипов полевковых Arvicolinae. Хромосомные пробы M. agrestis локализованы на хромосомах 17 других видов полевковых, выявлена межхромосомная гомология кариотипов исследованных видов.

Впервые по результатам пэйнтинга составлена хромосомная карта, включающая сравнение кариотипов 15 видов полевковых Arvicolinae. Это позволило наглядно представить гомологичные ряды хромосом, описать кариотипические преобразования, свойственные представителям этого подсемейства. В дальнейшем такие хромосомные карты могут быть использованы в качестве первичного материала для картирования геномов исследованных видов.

Предложены предковые кариотипы для представителей рода Microtus, рода Ellobius и подсемейства Arvicolinae. Реконструкция предкового кариотипа подсемейства необходима для воссоздания полной картины кариотипической эволюции, приведшей к формированию хромосомных наборов исследуемых ныне живущих видов.

Впервые на основе сравнения истинно гомологичных районов хромосом построено филогенетическое древо, отражающее возможный ход кариотипической эволюции полевковых Arvicolinae. Полученные результаты в совокупности с данными зоологических, палеонтологических и молекулярно-генетических исследований, могут быть полезны для уточнения таксономического положения некоторых видов полевковых, для выявления факторов, обуславливающих хромосомные преобразования, и для оценки скорости кариотипической эволюции видов этого подсемейства.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: 1) Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы». Новосибирск, 26-29 июня 2005 г.; 2) ХV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра". Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005 г.; 3) Динамика генофондов растений, животных и человека. Отчетная конференция. Москва 2005.; 4) Динамика генофондов растений, животных и человека. Отчетная конференция. Москва, ФИАН 2007 г.; 5) V конференция молодых ученых СО РАН, посвященная М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 20-22 ноября 2007г.

Вклад автора. При непосредственном участии автора были получены культуры первичных фибробластов, суспензии метафазных хромосом, проведено C- и G-дифференциальное окрашивание и анализ хромосом значительной части животных, вовлеченных в исследование. Амплификация и мечение зондов, выделение Cot10 ДНК M. rossiaemeridionalis и флуоресцентная in situ гибридизация проводились автором самостоятельно. Автором была проведена локализация пэйнтинг-проб пашенной полевки на хромосомы 16 из 18 видов, вовлеченных в данное исследование. Гомологичная гибридизация пэйнтинг-проб M. agrestis и гетерологичная гибридизация с метафазными хромосомами M. rossiaemeridionalis была выполнена сотрудниками лаборатории: Н.А. Сердюковой и к.б.н. Н.В. Рубцовой. Раскладки хромосом для иллюстрации кариотипов M. arvalis, M. rossiaemeridionalis, M. socialis, B. aghanus и C. gud были выполнены ранее к.б.н. О.В. Саблиной (Sablina et al. 2006). Автор принимал также непосредственное участие в обработке, анализе и описании полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (160 ссылок) и два приложения. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и содержит 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе была использована систематика Массера и Карлетона (Musser, Carleton 2005), построенная на основе сопоставления современных данных морфологического, цитогенетического и молекулярного анализа.

Виды, вовлеченные в исследование.

Триба Arvicolini. A. terrestris (amphibius) (ATE) 2n=36; B. afghanus (BAF) 2n=58; C. gud (CGU) 2n=54; L. brandtii (LBR) 2n=34; р. Microtus п/р Alexandromys: M. oeconomus (MOE) 2n=30, группа “clarkei” – M. clarkei (MCL) 2n=50, группа “ maximowiczii ” – M. maximowiczii (MMA) 2n=41; п/р Microtus: группа “agrestis” – M. agrestis (MAG) 2n=50, группа “arvalis” – M. arvalis хромосомная форма “arvalis” (MARA) 2n=46, M. rossiaemeridionalis (levis) (MRO) 2n=54; группа “socialis” – M. dogramacii (MDO) 2n=48, M. guentheri guentheri (MGUG) 2n=54, M. socialis (MSO) 2n=62; р. Microtus п/р Stenocranius – M. gregalis (MGR) 2n=36; р. Microtus п/р Terricola группа “subterraneus” – M.daghestanicus (MDA) 2n=54.

Триба Dicrostonychini. D. torquatus (DTO) 2n=45+B.

Триба Ellobiusini. р. Ellobius: п/р Afganomys – E. lutescens (ELU) 2n=17, п/р Ellobius – E. talpinus (2n=54).

Триба Myodini. р. Eothenomys: E. proditor (EPR) 2n=32, E. miletus (EMI) 2n=56. р. Clethrionomys (Myodes) – C. rutilus (CRU)2n=56.

Культуры клеток и суспензии метафазных клеток.

Культивирование клеток, получение суспензий метафазных клеток и приготовление препаратов проводили по стандартным методикам (Графодатский, Раджабли 1988; Henegariu et al. 2001; Nesterova et al. 2004) с небольшими модификациями. Суспензия хромосом E. lutescens предоставлена д.б.н. Баклушинской И.Ю. и д.б.н. Ляпуновой Е.А.

Дифференциальное окрашивание хромосом. GTG-окрашивание проводили по методике Сибрайт (Seabright 1971), С-окрашивание проводили по методике Самнера (Samner 1972). Оба метода были немного модифицированы (Графодатский, Раджабли 1988).

Хромосомный пэйнтинг проводили на дифференциально окрашенных метафазных хромосомах по методу Янга (Yang et al. 1995) с небольшими модификациями. В работе использовали Cot10 ДНК M. rossiaemeridionalis. Все используемые в работе пэйнтинг-пробы предоставлены группой ветеринарной цитогенетики Кембриджского университета (Англия): проф. Фергюсон-Смит, д-р Янг, д-р О’Брайен.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Локализация хромосомных проб Microtus agrestis на хромосомы видов подсемейства Arvicolinae.

Кариотипы полевковых Arvicolinae были проанализированы при помощи хромосомоспецифичных пэйнтинг-проб M. agrestis (2n=50). FISH проводили с супрессией повторенных последовательностей ДНК, поэтому сравнительный анализ результатов пэйнтинга отражает гомологию только эухроматиновых районов хромосом. Номенклатура хромосом в кариотипах большинства исследованных видов соответствует номенклатурам, приведенным в “Атласе кариотипов млекопитающих” (Sablina et al. 2006). Порядок расположения хромосом в кариотипах M. agrestis и M. oeconomus приведен согласно описанию Модая (Modi 1987).

Кариотип M. oeconomus занимает важное место в настоящем исследовании. Ранее в нашей лаборатории на хромосомы M. oeconomus были локализованы хромосомные пробы Mesocricetus auratus и Mus musculus. В данной работе на основе хромосомного пэйнтинга была установлена гомология всех хромосомных элементов кариотипа M. oeconomus с хромосомами M. agrestis (Рис. 1). Совокупность полученных данных позволила сравнить виды подсемейства Arvicolinae с видами подсемейства Cricetinae.

Рисунок 1. GTG-окрашенные метафазные хромосомы M. oeconomus. Вертикальными линиями показана локализация соответствующих хромосомных проб M. agrestis (MAG), M. auratus (MAU) и M. musculus (MMU) на хромосомы M. oeconomus.

Для подтверждения точности прямой локализации хромосомных проб M. agrestis на хромосомы D. torquatus был проведен обратный пэйнтинг с использованием хромосомных проб D. torquatus (Рис. 2). Не было выявлено дополнительных внутрихромосомных перестроек. Данные анализа позволили установить точки эволюционных разрывов в хромосомах исследованных видов.

Рисунок 2. GTG-окрашенные метафазные хромосомы M. agrestis. Вертикальными линиями показана локализация соответствующих хромосомных проб D. torquatus.

С помощью пэйтинг-проб Microtus agrestis были проанализированы кариотипы 17 видов из 8 родов подсемейства Arvicolinae: 9 видов из рода Microtus, 2 вида из рода Ellobius и по одному виду из родов Blanfordimys, Lasiopodomys, Clethrionomys, Chionomys, Arvicola и Dicrostonyx. Установлена гомология всех хромосом M. agrestis с хромосомными элементами кариотипов исследованных видов.

Дополнительно был проведен анализ результатов сравнительного хромосомного пэйнтинга между тремя видами полевок: M. clarkei (род Microtus), E. proditor и E. miletus (род Eothenomys) (Li et al. 2006). Сопоставление GTG-исчерченности хромосом этих видов с хромосомами M. agrestis позволило включить их в общую схему кариотипических преобразований полевковых Arvicolinae на основании гомологии хромосомных элементов.

Совокупные данные, полученные при сравнительном хромосомном анализе 21 вида из 9 родов полевковых, представлены в итоговой таблице (Табл. 1). В ней отражены все ассоциации и разрывы хромосомных элементов M. agrestis (MAG), характерные для кариотипов исследованных видов. Для каждого вида в верхней правой строке приведены ассоциации, в нижней правой строке – разрывы хромосомных элементов M. agrestis.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»