WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 9 |

По теме диссертацииопубликовано 28 печатных работ, в том числе 8статей в журналах, рекомендованных ВАКМинобрнауки РФ для опубликованиярезультатов диссертационныхисследований.

Объем и структурадиссертации

Диссертация изложена на223 страницах машинописного текста исостоит из введения, обзора литературы, 7глав, посвященных описанию материалов иметодов исследования, изложениюсобственных результатов исследования и ихобсуждению, выводов, практическихрекомендаций, списка литературы. Списоклитературы содержит 220 источников, в томчисле 42 отечественных и 178 зарубежныхавторов. Работа иллюстрирована 7 таблицамии 95 рисунками.

Апробация результатовисследования

Основные материалыисследования доложены на следующихконференциях и конгрессах: 2 и 3 Российскихконгрессах по патофизиологии (Москва, 2001,2004), Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006), Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006), II, III, IV Международныхнаучно-практических геронтологическихконференциях «Пушковские чтения»(Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008), IVВсероссийской научно-практическойконференции «Общество, государство имедицина для пожилых» (Москва, 2007), XIVРоссийском национальном конгрессе«Человек и лекарство» (Москва, 2007), Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006),Международном Конгрессе«Социальная адаптация, поддержка издоровье пожилых людей в современномобществе» (Санкт-Петербург, 2007), VIЕвропейском конгрессе по геронтологии(Санкт-Петербург, 2007), XII Конференции«Пожилой больной» (Москва, 2007),Межрегиональной научно-практическойконференции «Медицинские проблемыпожилых» (Йошкар-Ола, 2007), Конгрессе«Человек и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008).

Основноесодержание работы

Материалы иметоды исследования

Экспериментальныеживотные

Основу настоящего исследования составилиэкспериментальные наблюдения, выполненныена животных, полученных из виварияЧелябинской государственной медицинскойакадемии (ЧГМА).

Все исследованияпроведены на 90 беспородных кроликах обоегопола в возрасте 36-48 мес. с массой тела 4,5-5,5кг (старые животные). Все животные до и вовремя проведения эксперимента содержалисьв условиях стационарного вивария настандартном пищевом рационе при свободномдоступе к воде.

В пределах каждой возрастной группыпо каждому виду экспериментальныхживотных проводили разделение на животных,у которых моделировали какое-либоповреждение, и на животных, у которыхповреждение сочеталось сэкспериментальным терапевтическимвоздействием.

Все исследования сучастием животных проводили в строгомсоответствии с требованиями Хельсинкскойдекларации Всемирной медицинскойассоциации 1964 г. с изменениями от 1975, 1983 и 1989гг.

Исследование регенераторнойспособности плоских костей

Регенераторнуюспособность плоских костей черепа изучалипо авторской методике [Курилов И.Н. и соавт.,2008]. Кролику в теменной области производилитрепанацию черепа (площадь дефекта равна22 см).Состояния наркоза достигали введениемкетамина в дозировке 0,5 мг/кг. Кровотечениеиз эмиссариев останавливалиэлектрокоагуляцией. Пластика костногодефекта производили сингенным хрящом изрёберно-грудинного сочленения, вложенныммежду двумя слоями тонко нарезаннойгемостатической губки (по типу“сэндвича”). Операционные раны ушивалипослойно с соблюдением правил аспетики иантисептики. Контрольные гистологическиеисследования и рентгенографию черепапроводили последовательно с интервалом в 7дней с момента операции вплоть до полногозамещения дефекта костной ткани.

Исследованиерегенераторной способности трубчатыхкостей

Изучение регенераторнойспособности трубчатых костей проводили поавторской методике [Курилов И.Н. и соавт.,2000, 2001, 2005]. Животному, находящемуся всостоянии наркоза (кетамин, 0,5 мг/кг), вплощадку бедра (послойно вскрывая всеткани) вводили тефлоновую фистулу длиной 0,5см оригинальной конструкции [Курилов И.Н. исоавт., 1997, 1998], которая шёлковой лигатуройфиксировалась к бедренной кости. Раныушивали послойно с соблюдением правиласептики и антисептики. Контрольныегистологические исследованиянарастающего костного мозга проводилипоследовательно с интервалом в 7 дней послеоперативного вмешательства.

Изучение регенераторнойспособности трансплантированногосингенного костного мозга invivo

Исследованиерегенераторной способности костного мозгапроводили на авторской моделикультивирования сингенного костного мозгав брыжейке тонкого кишечника кролика[Курилов И.Н. и соавт., 2000, 2001]. Состояниянаркоза достигали введением кетамина вдозировке 0,5 мг/кг. После удаленияшерстяного покрова с передней брюшнойстенки и области скакательного суставакролика животному производили срединнуюлапаротомию с доступом к брыжейке тонкогокишечника. Из эпифиза бедра забиралицельный костный мозг в количестве 1 мл итотчас же вводили шприцем, содержащим 4 ЕДгепарина, между листками брыжейки вблизисосудистых аркад. Операционные раныушивали послойно с соблюдением правиласептики и антисептики.

Оценку результатов производилипоследовательно с интервалом в 7 сутокпосле оперативного вмешательства прирелапаротомиях визуально (по цветутрансплантата) и гистологически(эктопические очаги гемопоэзаиссекали).

Моделированиеэкспериментальных повреждений кожи улабораторных животных

Модель эксцизионных ран

Симметричные участки кожиэкспериментального животного (55 см) вручнуюосвобождали от шерстяного покрова.Состояния наркоза достигали введениемкетамина в дозировке 0,5 мг/кг.Хирургическим зажимом типа “Москит” кожупо центру участка захватывали иприподнимали, после чего хирургическиминожницами на обоих участках производиливыстригание кожи на всю глубину вплоть дофасции.

Оценку результатов производиливизуально ежедневно и гистологическипоследовательно с интервалом в 7 дней отмомента операции.

Модель ожога

Симметричные участки кожиэкспериментального животного (55 см) вручнуюосвобождали от шерстяного покрова.Состояния наркоза достигали введениемкетамина в дозировке 0,5 мг/кг. Раскаленнымпредметом на коже создавали участок ожогадиаметром 2 см у кролика.

Оценку результатов производиливизуально ежедневно и гистологическипоследовательно с интервалом в 7 дней отмомента ожога

Гистологические методыисследования

Гистологическоеисследование проводили общепринятымметодом. Для этого кусочки кожи, брыжейки икостной ткани фиксировали в 10% нейтральномформалине (рН 7,2) и заливали в парафин.Обзорную окраску проводили гематоксилиноми эозином. Коллагеновые и эластическиеволокна окрашивали пикрофуксином по ванГизону.

Электронно-микроскопический методисследования

Дляэлектронно-микроскопическогоисследования были взяты биоптаты из дна икраевых отделов раневого дефекта, а такжерубцовая ткань. Извлеченныеобразцы тканей с помощью лезвия нарезалина кусочки размером 1мм3 в каплеглютаральдегида (2,5%). Для фиксациииспользовали смесь Карновского, состоящуюиз 25% раствора глютаральдегида (10 мл), 40%раствора формальдегида (5 мл) и 0,1 М растворафосфатного буфера рН 7,2-7,4 (85 мл). Материалфиксировали в смеси Карновского в течение 2ч при комнатной температуре с последующейдофиксацией в 1% растворе четырехокисиосмия в течение 1 ч при комнатнойтемпературе.

После промывки иобезвоживания в спиртах восходящейкрепости образцы ткани пропитывали изаливали в смесь эпонов, состоящей из двухсоставных компонентов: смеси А - 62 мл эпона812 и 100 мл DDSA (додецил-янтарный ангидрид) исмеси В - 100 мл эпона 812 и 89 мл MNA (метил-надикангидрид). Полную смесь эпонов готовили из2,5 мл смеси А, 2,5 мл смеси В и 0,15 мл (4 капли)отвердителя DMP-30 (2, 4, 6три(диметил-аминометил)-фенол).Полимеризацию залитого материалапроводили в течение ночи в термостатах притемпературе 37°С и затем в течение 24 ч притемпературе 58°С.

Ультратонкие срезы(толщиной 150-50 нм) готовили наультрамикротоме LKB-7A (LKB, Швеция) сприменением аппарата для изготовлениястеклянных ножей KNIF - MARKER LKB-91 (LKB, Швеция). Кножу прикрепляли специальные ванночки,наполненные дистиллированной водой, наповерхность которой срезы переходили прирезке.

Полученные такимобразом ультратонкие срезы монтировали на«бленды» - медные сетки диаметром до 3 мм,которые имели на своей поверхностиотверстия диаметром 0,01 мм, что позволялоисследовать в электронном микроскопе 8-10полей зрения. Для избежания деформациисрезов при действии электронного лучапредварительно на чистые сетки наносилиопорную пленку из раствора формвара, накоторую снимали срезы с поверхности воды.

Дляэлектронно-микроскопическогоисследования срезы на блендахконтрастировали сначала 4,5% растворомуранилацетата в течение 10 мин. с тщательнойпоследующей промывкой сетокдистиллированной водой, затем еще втечение 10 мин. цитратом свинца помодифицированному методу Рейнольдса вприсутствии едкого натра для поглощенияСО2 также споследующей промывкой.

Электронно-микроскопическиеисследования проводили на электронноммикроскопе JEM - 100S (JEOL, Япония) втрансмиссионном режиме.

Компьютерный анализэлектронно-микроскопическихизображений

Морфометрический анализультраструктуры фибробластов наархивированных электроннограммахпроводили с использованием программногообеспечения «Видеотест-Морфология 5.0».Анализировали по 10электронно-микроскопических изображенийфибробластов эксцизионной раны на 7, 14, 21 и 28сутки заживления (соответственно, безвведения хондролюкса – контроль и привведении пептида). Анализ электроннограммпроводили при увеличении 4500. Определяли объемную плотность органоидов (Vv)– митохондрий,шероховатого эндоплазматическогоретикулума, рибосом, лизосом имикропиноцитозных везикул (МПВ) в % отобщего объема цитоплазмы. Указанный параметр являетсяобщепринятым при изученииультраструктурных признаковфункциональной активности клеток.

Статистическуюобработку результатовэлектронно-микроскопическогоисследования проводили спомощью компьютерной программыSTATISTICA 5.0 (Statsoft).

Экстракты эмбриональныхтканей

В работе использовали14-дневные куриные эмбрионы. Скорлупу яицобрабатывали 70% раствором этиловогоспирта, после чего скорлупу разбивали,грудную и брюшную полости зародышейвскрывали, а затем осторожно извлекализародышевые органы: печень, сердце исосудистый пучок, хрящевую и костную ткани.Полученные органы раздельногомогенизировали в стеклянном ручномгомогенизаторе в присутствии среды RPMI сглутамином, центрифугировали в течение 10минут при скорости вращения 5000 об/мин.,надосадочную жидкость аккуратно сливали иразводили средой RPMI с глутамином в 2 раза,после чего трижды замораживали иоттаивали. Полученные комплексныепрепараты из эмбриональной печени,эмбрионального сердца и эмбриональнойхрящевой и костной тканей разливали постерильным флаконам и хранили притемпературе - 20С.

Препараты использовалив виде аппликаций на поверхность ожога илираны экспериментальных животных приперевязках, производимых ежедневно.

Методыизучения экстрактов эмбриональныхтканей

Определениехемотаксической активности нейтрофилов впериферической крови

Под эфирным наркозом у крыс изглазного сосудистого пучка получали 4-5 млкрови. Кровь стабилизировали гепарином (125ед/мл) с добавлением 6%-ного растворадекстрана в соотношении 4:1. Для получениялейковзвеси кровь отстаивали в темостате втечение 30 мин. Плазму наслаивали на двойнойградиент плотности фиколл-урографина:плотность нижнего градиента составляла 1,095г/см3, плотностьверхнего градиента – 1,077 г/см3;объём верхнего и нижнего градиентов по 1 мл,объём плазмы –2-3 мл. Полученную жидкостьцентрифугировали в центрифужной пробиркев течение 40 мин при скорости вращения 1500об/мин. Пипеткой снимали кольцонейтрофилов (объём около 1 мл) и трёхкратноотмывали 2 мл раствора Хэнкса по 7-10 мин при1500 об/мин. Полученные нейтрофилывзвешивали в 100 мл питательной среды 199 иресуспендировали пипетированием, послечего вносили в лунки агарозного геля по 10-15мкл. В соседние лунки вносили изучаемыевещества (экстракт эмбриональной печени,экстракт эмбриональных хрящевой и костнойтканей, экстракт эмбрионального сердца исосудистого пучка).

В качестве контроляоценивали хемотаксис нейтрофилов к С5акомпоненту комплемента, к Staphylococcus aureusштамма 209 и к среде 199. Агарозный гель схемоаттрактантами инкубировали втермостате в течение 2,5часов при температуре 37оС в среде сповышенным содержанием СО2 (5%). По окончанииинкубации материал фиксировали в 47%растворе формалина в течение 30 мин. Стёклапромывали проточной водой, высушивали.Учёт результатов исследования проводилимикроскопическим методом с помощьюокулярного микрометра при увеличении70. Измеряли 2зоны миграции: к хемоаттрактанту (а) и отнего (в). Индекс хемотаксиса (ind) вычисляликак соотношение а/в. При значении индексахемотаксиса более 1 хемотаксис считалиположительным, при значении индекса 1хемотаксис - сомнительным, при значениииндекса менее 1 хемотаксис считалиотрицательным.

Определениепротеолитической активностиэмбриональных экстрактов

Определение активностиколлагеназ проводили методом прямойзимографии.

Приготовление геля: наводяной бане готовили 1% гель агарозы нафосфатном буфере (рН 8,0) с добавлением 2 млглюконата кальция на 100 мл буфера и 0,1%желатина. Сразу после приготовления гельзаливали в «сэндвич» из стёкол, шириназазора между которыми (1 мм) была ограниченапластиковыми пластинами. По периметру«сэндвич» герметизировали клейкойлентой.

Проведение зимографии:через 0,5 ч после застывания гель осторожноснимали со стёкол, помещали в чашку Петри инаносили пробы тканей куриного эмбриона(экстракт эмбриональной печени, экстрактэмбриональных хрящевой и костной тканей,экстракт эмбрионального сердца исосудистого пучка), в качестве контроляиспользовали ткань печени взрослой крысы.Чашку Петри закрывали и помещали втермостат при температуре 37С на 16 часов.

Фиксация и окраска:после отмывания геля в водопроводной водеосуществляли фиксацию зимографическойкартины в 20% растворе уксусной кислоты.Окрашивание геля производили красителемкумасси блу (состав красителя: 0,5 г кумассиблу, 20 мл 20% раствора уксусной кислоты, 5 млизопропилового спирта, 10 мл 70% этиловогоспирта, воды водопроводной до 100 мл). Времяокрашивания составляло 20 мин.

Затем проводили отмывкугеля в смеси 70% этилового спирта и 20%раствора уксусной кислоты в соотношении 1:1в течение 10 мин, после чего гель отмывали в5% растворе уксусной кислоты в течение 1ч.

Оценку коллагеназнойактивности тканей проводили путёмизмерения диаметра зон обесцвечиваниягеля.

Содержание белка вэкстрактах эмбриональных тканей

Белок в экстрактахкуриных эмбриональных тканей определялимикрометодом с реактивом Бенедикта.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 9 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»