WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |

Использовали такжеколонку среднего давления с неподвижнойфазой «Супероза-12» («Фармация», Швеция)1,650 см.Скорость элюирования составляла 2,0 мл/мин(при использовании тех же элюентов, что идля предыдущей колонки). В качестведетектора использовали проточныйультрафиолетовый детектор с длиной волны280 нм, которая является наиболееспецифической для белков и пептидов. Обеколонки откалиброваны по стандартномунабору водорастворимых глобулярных белковпроизводства фирмы «СЕРВА» (Германия) вдиапазоне молекулярных масс (и,соответственно, времен удерживания) отсвободного до полного объема.

Массовуюдолю общего азота в препаратах определялина анализаторе 1130-AUTO-Kjeltek-3, содержаниеаминного азота определяликолориметрическим методом с реагентом2,4,6-тринитробензолсульфокислотой пометодике Воробьева с соавторами. Фракционирование азотистых веществ,а также изучение их состава и свойствпроводили по известным методикам; массовую долю аминокислот - послегидролиза белков в 6 Н НСl на автоматическомаминокислотном анализаторе «ААА-400».Аминокислотный скор рассчитывали сиспользованием шкалы ФАО для идеальногобелка.

Массовую долюфенилаланина определяли методомвысокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ) на колонке «Nucleosil 300-5C18» 5 мкм, 2504,6мм. Использовали в изократическом режимежидкостной хроматограф «MERCK HITACHI» (Япония) сультрафиолетовым детектором UV L-7400 и длинойволны 220 нм.

Определение протеолитическойактивности проводилиспектрофотометрическим методом сиспользованием в качестве субстратагемоглобина по Фармакопейной статье ФСП 420308-1449-01.

Остаточную АГ в ФГМБ определяли пометоду торможения непрямого твердофазногоиммуноферментного теста на полистироле. Воснову метода положена конкуренцияантигена, растворенного в объеме образца итакого же антигена, иммобилизованного натвёрдой фазе (полистироле) за связывание сограниченным количеством специфическихантител, растворённых в объёме образца.Путем построения графика в координатахдесятичный логарифм разведения (осьабсцисс) - ингибирование реакции в % (осьординат) рассчитывали методом линейнойинтерполяции концентрацию 50%ингибирования (ID50) для исследуемого (ФГМБ) истандартного (белок молока, белок молочнойсыворотки) образцов. На основании этихданных определяли остаточную АГисследуемого образца в долях от АГстандартного образца и кратность сниженияантигенных свойств в ходе обработки.

Результатыэкспериментов обрабатывали общепринятымистатистическими методами на ЭВМ сиспользованием пакетов программ EXCEL 2003 и SPSS9.0 и 11.5 для Windows.

Глава 4. Оптимизацияпроцессов ФГ молочных белков (КМБ иКСБ). Разработка технологиигидролизатов с заданным составом исвойствами сводится, главным образом, кполучению препаратов с необходимойстепенью гидролиза, которая в свою очередь,зависит от многих факторов. В качествесубстрата использовали системы,содержащие концентрат молочного белка(КМБ) с соотношением «казеин - сывороточныебелки» (К/С), равным 80/20 (нативноесоотношение казеинов и сывороточныхбелков, присущее молоку), и концентратбелка молочной сыворотки (КСБ),характеризуемый указанным соотношениемравным 3/97 (соотношение, определяемоеприсутствием, в основном, сывороточныхбелков со следовыми количествамиказеинов). В результате анализалитературных источников и поисковыхисследований в лабораторных условиях сцелью получения ФГМБ со средней и глубокойстепенью гидролиза выбраны ферментныепрепараты «Панкреатин» и «Флавоэнзим»,соответственно. В первой серииэкспериментов изучены ММР ФГМБ,свидетельствующие о накоплении в нихразличных пептидов и аминокислот вусловиях обработки высокоактивнымпромышленным ферментным препаратом«Панкреатин». В табл. 1 представленырезультаты гидролиза КМБ «Панкреатином» взависимости от продолжительностиобработки. Обработку проводили ферментом вколичестве 2% по массе сухих веществ,температуре 50+1оС иоптимальном для данного ферментногопрепарата значении рН 7,4-7,6, котороеподдерживали путём рН-статирования.

Таблица 1

ММР гидролизатов КМБ пригидролизе «Панкреатином»

через 2, 4 и 6 часовпроведения реакции

Диапазон молекулярных масс,кД

Относительное распределение,%

при продолжительностигидролиза, ч

2

4

6

1

Более166

2,2

3,6

3,5

2

166-28,2

3,2

1,3

2,2

3

28,2-11,0

3,9

2,9

1,7

4

11,0-4,0

21,1

19,1

19,1

5

4,0-1,4

24,1

20,5

21,6

6

Менее1,4

45,5

52,6

51,9

Как следует изпредставленных данных, ММР пептидов впродукте реакции практически неизменяется после 4 часов гидролиза, т.е.процесс по существу останавливается.Причина этого состоит, по-видимому, вбыстрой инактивации ферментов, входящих всостав «Панкреатина», как вследствиепроцесса автолиза, так и ингибированиякороткими пептидами - продуктами реакции. Вдальнейших экспериментах использовалипродолжительность обработки белковыхсубстратов «Панкреатином», равную 3 часам.

Таблица 2

ММР гидролизатов КСБ пригидролизе «Панкреатином» через 3 часареакции

в зависимости от наличиятепловой инактивации ферментногопрепарата

Диапазон молекулярных масс,кД

Относительное распределение,%

безинактивации

степловой инактивацией

1

Более166

6,5

4,4

2

166-28,2

3,6

1,2

3

28,2-11,0

3,6

3,0

4

11,0-4,0

19,2

21,9

5

4,0-1,4

14,2

15,4

6

Менее1,4

52,9

54,1

Как следует из данныхтабл. 2, пептидный профиль панкреатиновогогидролизата КСБ весьма сходен с таковымдля КМБ. Тепловая инактивация фермента поокончании процесса ФГ практически невлияет на распределение молекулярных масс,что свидетельствует об отсутствии взначительных масштабах процессовагрегации и сшивки пептидов, которые моглибы неблагоприятно повлиять набиологическую ценность получаемогоФГМБ

Результаты оптимизациипроцесса протеолиза по показателюфермент-субстратного соотношенияпоказали, что увеличение концентрации«Панкреатина» выше 1,5% по массе сухихвеществ практически не сказывается наглубине гидролиза (табл. 3). В этой связиконцентрация «Панкреатина» 1,5-2,0% по сухимвеществам является оптимальной при ФГбелков коровьего молока.

Таблица 3

ММР гидролизатов КСБ взависимости от фермент/субстратногосоотношения

Диапазон молекулярных масс,кД

Относительное распределение,%

при фермент/субстратногосоотношении, %

0,5

1,5

3,0

1

Более166

9,9

4,5

1,9

2

166-28,2

12,3

3,8

2,4

3

28,2-11,0

22,7

4,6

3,3

4

11,0-4,0

22,9

27,1

29,4

5

4,0-1,4

8,8

20,1

20,5

6

Менее1,4

23,4

39,9

42,5

Проведение протеолизабелков молока панкреатином вблизи егорН-оптимума (рН 7,4-7,6) требует постоянногорН-статирования раствором щелочивследствие закисления реакционной смесивысвобождаемыми карбоксильными группамипептидов и аминокислот. При этом в составегидролизата накапливаются ионы натрия иликалия, вносимые с раствором щелочи, чтонеблагоприятным образом сказывается наего пищевой ценности и органолептическихсвойствах. В связи с этим, изученавозможность проведения ферментолиза«Панкреатином» без рН-статирования (табл.4).

Таблица 4

ММР гидролизатов КСБ пригидролизе «Панкреатином», полученныечерез

4 и 6 часов проведенияреакции без подведения рН

Диапазон молекулярных масс,кД

Относительное распределение,%

при продолжительностигидролиза, ч

4

6

1

Более166

13,2

11,0

2

166-28,2

2,6

1,9

3

28,2-11,0

5,7

5,6

4

11,0-4,0

25,0

22,2

5

4,0-1,4

12,5

14,5

6

Менее1,4

41,0

44,8

Представленныерезультаты (для субстрата КСБ),свидетельствуют о меньшей глубинегидролиза белка в этих условиях, еслисудить по выходу пептидов в диапазоне 1,4-4,0и менее 1,4 кД (в сравнении с табл. 2).

Таким образом, гидролиз«Панкреатином» без рН-статирования можетиспользоваться в тех случаях, когдаглубокий гидролиз белка нетребуется.

Оптимизация процессаполучения ФГМБ под действием панкреатинапо показателю температуры позволилаустановить, что наилучшие результатыдостигаются при 50+1оС. Приболее высоких температурах происходитбыстрая инактивация фермента, а припониженных (37+1оС)резко снижается атакуемость рядаиндивидуальных белков в составе КСБ (таких,как -лактоглобулин), и они выявляются нахроматограммах гидролизатов в виде пиков сне измененной молекулярной массой.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»