WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |


На правах рукописи

УДК 575.1:575.11: 575.224.4:595.773.4

КОВАЛЕНКО ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА

hobo-ЭЛЕМЕНТ КАК ФАКТОР НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА

Drosophila melanogaster В КЛЕТКАХ ГЕНЕРАТИВНЫХ И СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2007

Работа выполнена в Лаборатории генетики популяций

Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Захаров Илья Кузьмич

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бугров Александр Геннадьевич

Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук

Омельянчук Леонид Владимирович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Кафедра генетики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита диссертации состоится 19 сентября 2007 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090.

тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан “____” августа 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мобильные генетические элементы (МЭ) являются важными объектами исследования современной генетики. Они распространены повсеместно и составляют существенную часть геномной ДНК многих изученных организмов. МЭ способны увеличивать число своих копий в геноме хозяина, и, благодаря определенной структурной организации, могут перемещаться как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. МЭ существенно влияют на структуру генома, встраиваясь в гены или окрестности генов и вызывая генные мутации, являясь причиной хромосомных перестроек, изменяя – как понижая, так и повышая – уровень активности генов (Kidwell, Lisch, 1997). Возникающие мутационные изменения могут не сказываться на жизнеспособности организма. В редких случаях мутационные изменения могут иметь адаптивное значение, однако, чаще всего, мутации вредны для организма и приводят к стерильности или гибели особей.

Перемещения МЭ у дрозофилы происходят преимущественно в клетках зародышевого пути. Попытки выявить активность МЭ в клетках соматических тканей долгое время не были успешными, и сохранялось представление о том, что перемещения МЭ у дрозофилы ограничены половыми клетками (Thompson et al., 1977; Engels, 1979; Bingham et al., 1982; McElwain, 1986). Большая часть этих работ была проведена с использованием генетических методов и моделей на линиях Drosophila melanogaster при Р-М-гибридном дисгенезе. Молекулярными методами было подтверждено, что перемещения Р-элемента в клетках соматических тканей заблокированы за счет особенностей сплайсинга (Laski et al., 1986). Для hobo-элемента так же предполагается тканеспецифичная регуляция продукции транспозазы, но на уровне транскрипции (Calvi, Gelbart, 1994). В ряде работ были описаны случаи перемещения ретротранспозонов в соматических тканях у высших организмов (Georgiev et al., 1990; Kim, Belyaeva, 1991; Driver, McKechnie, 1992). Что касается транспозонов, до сих пор сохраняется неясность в вопросе о возможности их перемещения в соматических клетках у Drosophila melanogaster. Выявление возможности и изучение особенностей транспозиций МЭ в соматических клетках имеет большое значение, поскольку в ряде работ описан повреждающий эффект соматических перемещений Р-элемента (Engels et. al., 1987; Woodruff, 1992). Более того, соматические мутации представляют собой потенциальную угрозу малигнизации клеток.

hobo относится к классу транспозонов. Наряду с Р- и I-элементами, hobo-элемент обусловливает гибридный дисгенез у D. melanogaster (Bingham, 1982; Blackman et al., 1987; Yannopoulos et al., 1987; Bucheton, 1990). Считается, что hobo-элемент внедрился в геном Drosophila melanogaster в прошлом столетии и, в связи с этим, очень активен и вызывает большое количество мутаций (Kidwell et al., 1983; Pascual, Periquet, 1991).

Исследование активности hobo-элемента мы проводили на линиях популяции Drosophila melanogaster Умани, где была обнаружена вспышка мутабильности по гену yellow, которая продолжалась с 1982 по 1991 гг. (Захаров, Голубовский, 1985; Голубовский и др., 1987; Захаров, Скибицкий, 1995). Причиной вспышки явился hobo-элемент, который внедрился в регуляторную область гена yellow, и в результате событий, таких как инверсии, реинверсии, делеции ДНК, происходивших между копиями hobo-элементов в гене yellow и его окрестностях, у мух наблюдалась высокая частота мутирования от нормального фенотипа к мутантному и обратно (Грачева и др., 1998; Захаренко и др., 2004). Было показано, что помимо сайта в гене yellow существуют и другие сайты гибридизации hobo в геноме уманских линий (Захаренко и др., 2000, Захаренко и др., 2004), однако оставался открытым вопрос об активности hobo в других точках его локализации в геноме.

Изучение особенностей поведения в геномах разных линий D. melanogaster широко распространенного в природных популяциях hobo-элемента является актуальным, поскольку МЭ имеют существенное значение в формировании генетической изменчивости.

Цели и задачи работы. Целью данной работы является исследование транспозиционной активности hobo-элемента в клетках генеративных и соматических тканей в линиях Drosophila melanogaster, выделенных из природной популяции Умани в период вспышки мутаций по гену yellow.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Описать распределение полноразмерных и делетированных копий hobo-элементов в геноме D. melanogaster в природной популяции Умани в динамике за период 1979-2004 гг.

2. Оценить уровень нестабильности генов в Х-хромосомах линии y2-717 D. melanogaster Умани, используя метод рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций.

3. Провести исследование транспозиционной активности hobo-элементов в ряду последовательных поколений в линии y2-717 D. melanogaster и у производных этой линии на основе анализа паттерна сайтов локализации hobo в Х-хромосомах самцов.

4. Выявить наличие/отсутствие транспозиционной активности hobo в клетках соматических тканей hobo-содержащих линий D. melanogaster с использованием методов (1) соматических мутаций и рекомбинаций на клетках крыла и (2) флуоресцентной in situ-гибридизации на политенных хромосомах клеток слюнных желез.

5. Изучить влияние радиации, как внешнего мутагенного фактора, на картину распределения hobo-элементов в политенных хромосомах в линии y2-717 D. melanogaster.

Научная новизна работы. Для генетически нестабильных линий Drosophila melanogaster, выделенных из природной популяции Умани, впервые получены цитогенетические данные о распределении и транспозиционной активности hobo-элемента в гене yellow и других локусах Х-хромосомы, которые дополняют проведенные ранее молекулярно-генетические исследования локусспецифической нестабильности гена yellow. Показано, что нестабильность гена yellow исследованных y2-717-производных, вызванная активностью hobo-элемента, является маркером активности hobo- и Р-элементов в других локусах Х-хромосомы.

Впервые описано, что в y2-717-Х-хромосоме при проведении скрещиваний с самками со сцепленными Х-хромосомами (y2-717-Х-хромосома наследуется патрилинейно), наряду с межаллельными переходами в локусе yellow наблюдается увеличение числа копий hobo. В ряду y2-717-производных, отмечена особенность в поведении hobo-элементов – преобладание частоты инсерций над частотой эксцизий hobo в Х-хромосомах.

В выделенной из природной популяции Drosophila melanogaster y2-846-линии, не подвергавшейся воздействиям, индуцирующим транспозиции МЭ, обнаружена способность hobo к перемещениям в клетках соматических тканей.

Положения, выносимые на защиту. В результате проведенного исследования показано, что hobo-элемент проявляет высокую активность в клетках соматических и генеративных тканей уманских линий Drosophila melanogaster и обусловливает их генетическую нестабильность. Супернестабильность локуса yellow служит маркером активности hobo- и Р-элементов в Х-хромосоме в целом. Транспозиционная активность hobo-элементов исследованных систем после индуцирующих транспозиции скрещиваний способна сохраняться в течение многих десятков поколений и каждое новое скрещивание вызывает увеличение числа и частоты транспозиций hobo в Х-хромосомах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты развивают теоретическое представление о закономерностях поведения hobo в геноме дрозофилы, а также дополняют картину происходящих с hobo-элементом процессов в локусе yellow и в геноме линий уманской популяции Drosophila melanogaster.

В работе получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что hobo-элемент способен проявлять транспозиционную активность в клетках соматических тканей Drosophila melanogaster, выделенных из природной популяции.

Полученные результаты вносят вклад в представления об особенностях поведения транспозонов в соматических и генеративных тканях Drosophila melanogaster. Результаты работы следует учитывать в исследованиях, посвященных изучению активности МЭ у дрозофилы.

Результаты используются в курсе “Эволюционное учение” ФЕН НГУ.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 116 страницах, включает 27 рисунков и 11 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух. В работе изучали линии, выделенные из природной популяции Drosophila melanogaster Умани (Украина) с 1979 по 2004 гг., а также серию производных линий, полученных от уманской линии y2-717. При анализе использовали следующие лабораторные линии: С(I)DX,ywf/Y; Мёллер-5 – In (1) scS12 sc8R+S, scS1 sc8 wa B; маркерные линии mwh и flr3/TM3; линии-доноры полноразмерного hobo-элемента – линию Uc-1 (y59b z w1/Y), предоставленную Дж. Лимом, и линию Uc-1-U (y+w N+/Y), - рекомбинант по Х-хромосоме, полученный в результате скрещиваний между линиями Uc-1 и y2-743+pn cv v f B, нестабильной по гену yellow (рекомбинант получен Л.П. Захаренко); линию С(1)DXyf;2 (2), которая имеет Р-цитотип; линию-донора полноразмерного Р-элемента – Harwich; нормальные лабораторные линии Oregon R и Canton S.

Процедура получения производных линий. Серия производных линий была получена от линии y2-717 (рис. 1). Каждая новая производная линия брала начало от вновь возникающего фенотипически мутантного/нормального по гену yellow самца путем последующего скрещивания с самками со сцепленными Х-хромосомами С(I)DX,ywf/Y. Таким образом, самцы всех производных линий имеют одну и ту же Х-хромосому, ведущую свое происхождение от исходного самца линии y2-717 (производные линии были получены М.А. Волошиной).

Рис. 1. Схема получения производных линий D. melanogaster от исходной линии y2-717 из Умани. В скобках указан месяц и год получения производной линии.

Фенотипы: y2 - желтое тело, коричневые щетинки; y1 - желтое тело, желтые щетинки;

y1t - средний вариант между y2 и y1; y+ - серое тело.

Метод Мёллер-5 или РЦПЛМ для обнаружения и учета рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме. Девственных самок Мёллер-5 скрещивали с самцами контрольной (Canton S) и опытной (y2-717) линий. Фенотипически нормальных самок F1, гетерозиготных по Х-хромосоме, индивидуально скрещивали с самцами Мёллер-5. Если в Х-хромосоме самца-родителя летальная мутация не возникала, то в F2 в каждой семье должны быть представлены все 4 класса потомков в соотношении 1:1:1:1. Если же самка из F1 несла летальную мутацию, то в данной семье в F2 нормальные самцы отсутствовали (Медведев, 1968).

Тест на соматические мутации и рекомбинации (SMART) В тесте использовалась линия, несущая маркерную мутацию multi wing hairs (mwh; 3 - 0,3), расположенную на самом конце 3L-хромосомы, поэтому любые одиночные рекомбинации, происходящие в этом плече, можно выявить при анализе количества щетинок на клетках крыла имаго. Препараты делали из крыльев мух F1, полученных при скрещивании самок линии mwh с самцами анализируемых линий.

Облучение мух. Из потомков одной самки линии y2-717 сформировали группы, которые подвергали -облучению на установке 60Co по следующей схеме: дозой 30 Гр (группа 30-1) и 3 Гр (группа 3-1) однократно, дозой 30 Гр (группа 30-4) и 3 Гр (группа 3-4) четыре поколения подряд. В каждом поколении для облучения отбирали самцов и девственных самок в 1-3-дневном возрасте. После облучения 1го самца и 3-х самок помещали в пробирку, так формировали 30-40 семей в каждой группе. В опытных группах 3-1 и 30-1 анализировали личинок F1, в группах 3-4 и 30-4 – личинок F4. В группе 30-5/11 мух облучали 5 поколений подряд дозой 30 Гр (облучение этой группы проводила М. Перепелкина), анализ проводили спустя 11 поколений. В этом эксперименте была взята массовая культура линии y2717, отдельных семей не формировали.

Мечение ДНК зондов. В качестве зондов использовали клонированную ДНК полноразмерной копии hobo-элемента в составе плазмиды PsB4, предоставленную Дж. Лимом, а так же клонированную ДНК Р-элемента (pTurbo), предоставленную С. Демаковым. Мечение зондов проводили с помощью метода ник-трансляции. ДНК hobo-элемента метили biodUTP («Медиген» Россия), ДНК Р-элемента – дигоксигенином (Roche Diagnostics GmbH, Германия). Реакцию проводили с помощью набора для ник-трансляции («Медиген» Россия) в реакционной смеси объемом 50 мкл, включающей: 1 буфер, dATP, dCTP, dGTP по 0,08 мМ каждого, biodUTP – 0,04 мМ (для hobo) или 1 нМ digoxigenin-11-dUTP (для Р), ДНКполимераза I E. coli – 10 единиц, ДНКаза I – 4нг, ДНК PsB4 или pTurbo – 12мкг. Смесь инкубировали при 16°С в течение 2 час. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,5М EDTA.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»