WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Известно, что для эффективной биофункционализации необходимо введение небольшого количества фактора клеточного роста. Поэтому создание полифункционального полимерного вектора желательно проводить постадийно, с введением в его структуру BMP-2 на первой стадии. С одной стороны, связывание нескольких мкг белка приведет к незначительной конверсии альдегидных групп, а с другой, избыток последних при присоединении BMP-2 на первой стадии создания смешанного конъюгата должен обеспечить наиболее полное связывание фактора роста и дифференциации клеток.

Таблица 4

Количественные характеристики ковалентного связывания РНКазы с окисленной пМАГ и сополимером п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

[полимер]:[РНКаза],

масс. соотношение

[CHO]:[РНКаза],

мольн. соотношение

Конверсия белка,

моль%

окисленная пМАГ

2

33

4

5

83

7

10

166

31

20

337

43

п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

2

9

13

5

23

25

10

45

37

20

93

85

пМАГ: 30 моль% CHO-групп, MM 20000;

п(МАГ-со-ВП-со-Ак): 7 моль% CHO-групп, MM 13 500. Условия реакции: 0.01 M натрий-боратный буфер, pH 10.0, 25°C, перемешивание в течение 2 ч. (550 rpm). Очистка: диализ против воды (MWCO: 20000). Конверсия белка определена методом флуорометрии (ex.= 485 нм, em.= 538 нм), с использованием флуоресценции ФИТЦ.

Связывание поли-L-лизина. Аналогичным образом было исследовано связывание с полимерами поли-L-лизина (пЛиз, ММ~10000). Как и в случае белка, использовали избыток полимера. Необходимо отметить, что расчет количества связанного лиганда в данном случае проводился на звено лизина, поскольку молекулярная масса полимерного лиганда является средней величиной. Из Таблицы 5 видно, что максимальная конверсия аминогрупп достигается в случае окисленной пМАГ, содержащей наибольшее число альдегидных групп.

С учетом мольных соотношений альдегидных групп полимеров и аминосодержащих звеньев лизина в исходной реакционной смеси, конверсия аминогрупп, а, следовательно, и реакционная способность альдегидных групп, для обоих полимеров практически совпадают. Это можно объяснить наличием в более «рыхлой» по сравнению с белком макромолекуле пЛиз значительного количества стерически доступных -аминогрупп, что позволяет преодолеть диффузионные ограничения реакции с альдегидными группами полимера, имеющие место в случае РНКазы.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при постадийном синтезе полифункционального полимерного вектора целесообразно введение пЛиз в структуру смешанного конъюгата на второй стадии процесса, после связывания полимера с РНКазой (или BMP-2). В данном случае, достаточно большое число оставшихся после связывания белка альдегидных групп будут обеспечивать конъюгирование необходимого количества пЛиз, но, вместе с этим, после образования бинарного конъюгата полимер-РНКаза-пЛиз, количество свободных альдегидных групп все еще будет достаточным для связывания GRGDSP-пептида.

Таблица 5

Количественные характеристики ковалентного связывания пЛиз с окисленной пМАГ и п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

[полимер] : [пЛиз],

масс. соотношение

[CHO] : [звено Лиз],

мольн. соотношение

Конверсия NH2-групп,

моль%

окисленная пМАГ

5

0.85

49

10

1.70

59

20

3.39

75

40

6.78

82

п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

5

0.23

23

10

0.47

29

20

0.94

64

40

1.87

68

пМАГ: 30 моль% CHO-групп, MM 20 000;

п(МАГ-со-ВП-со-Ак): 7 моль% CHO-групп, MM 13 500. Условия реакции: 0.01 M натрий-боратный буфер, pH 10.0, 25°C, перемешивание в течение 2 ч. (550 rpm). Очистка: диализ против воды (MWCO: 3000). Конверсия белка определена методом флуорометрии (ex.= 485 нм, em.= 538 нм), с использованием флуоресценции ФИТЦ.

«Смешанные» конъюгаты

На основании полученных данных и разработанных количественных методов для характеристики моноконъюгатов был осуществлен контролируемый количественно синтез «смешанного» конъюгата.

Процесс проводили путем постадийного введения лигандов в структуру полимерного «вектора» (Рис. 4).

Рис. 4. Экспериментальная схема получения смешанного конъюгата путем последовательного ковалентного связывания биолигандов.

Обнаруженная конверсия вводимых биомолекул на каждой стадии конъюгирования подтвердила принципиальную возможность получения сложных конъюгатов, содержащих лиганды различной природы и функциональности.

На первых двух стадиях в структуру полимера-носителя вводили макромолекулярные лиганды, а именно, РНКазу и пЛиз, реакции которых с полимерами испытывают пространственные затруднения, а также требуют избытка альдегидных групп. На последней стадии в реакционную смесь, содержащую полимер, модифицированный указанными макромолекулами, вводили избыток низкомолекулярного GRGDSP-пептида.

Количественный контроль процесса смешанного конъюгирования отражен в Таблице 6.

Таблица 6

Количественные характеристики постадийного синтеза смешанного конъюгата,

содержащего РНКазу, пЛиз и GRGDSP-пептид

Стадия I

Стадия II

Стадия III

[полимер]:[РНКаза],

масс.

Конверсия

белка, моль%

[полимер]:[пЛиз],

масс.

Конверсия

NH2-групп, моль%

[СНО]:[NH2],

моль.

Конверсия

пептида, моль%

окисленная пМАГ

20 : 1

47

20 : 1

33

2.11

39

п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

30 : 1

58

30 : 1

15

0.61

25

Следует отметить, что при образовании «смешанного» конъюгата на каждой стадии модификация используемых полимеров биолигандами подчиняется закономерностям, полученным для моноконъюгатов. Этот факт позволяет контролируемо и воспроизводимо вводить необходимое количество лигандов в создаваемый полифункциональный полимерный «вектор» без дополнительного подбора условий для каждого случая.

3.3. Гидродинамические характеристики полимеров носителей и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера

Исследование гидродинамических характеристик полимеров-носителей и их конъюгатов с модельными лигандами различного молекулярного размера (глицин и РНКаза) осуществляли методами визкозиметрии, а также динамического и статического светорассеяния.

Величины гидродинамических радиусов, полученные методом вискозиметрии, свидетельствуют о том, что макромолекулы полимеров двух типов альдегидсодержащих полимеров на основе МАГ, а также их конъюгатов с глицином и РНКазой, обладают достаточно свернутой конформацией, обусловленной, по-видимому, внутримолекулярными взаимодействиями. На основании анализа концентрационных зависимостей уд/c альдегид-содержащих форм обоих типов полимеров было установлено наличие полиэлектролитного эффекта, а также, в случае окисленной пМАГ, образование ассоциатов при повышении концентрации полимера в растворе. Кроме того, поведение и структура конъюгатов полимер-глицин и полимер-РНКаза в водных растворах существенно зависят от химической структуры полимеров, распределения альдегидных групп в полимерной цепи и количества связанного лиганда (Таблица 7).

Данные, полученные методом светорассеяния (Таблица 8), позволили сделать вывод о наличии ассоциативных структур, как в случае исходных полимеров, так и конъюгатов, вероятно, обусловленных межмолекулярными взаимодействиями звеньев МАГ. При этом введение альдегидных групп и последующее их замещение лигандами различного молекулярного размера приводит к изменению гидродинамических параметров, что является еще одним свидетельством образования конъюгатов.

Таблица 7

Значения характеристической вязкости и рассчитанные гидродинамические параметры исходных и активированных полимеров, а также их конъюгатов с глицином и РНКазой

образца

Название образца

Растворитель

[], дл•г-1

нм

пМАГ

1

пМАГ

Na2SO4, 0.1 М

0.12

4.5

11.3

3.6

1

пМАГ

б/б, pH 10.0

0.15

4.9

12.1

3.9

2

окисленная пМАГ

б/р-р, pH 7.0

0.11

4.4

10.9

3.5

5

пМАГ-глицин (20 %)*

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»