WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Рис. 1. Схемы синтезов альдегид-содержащих полимеров-носителей на основе 2-деокси-N-метакрилоиламидо-D-глюкозы (МАГ, I).

Реакции: 1 – синтез МАГ; – гомополимеризация МАГ; – периодатное окисление полиМАГ (пМАГ); – сополимеризация МАГ с N-винилпирролидоном (ВП); - периодатное окисление звеньев МАГ в сополимере МАГ с ВП; 4 – сополимеризация МАГ с диэтилацеталем акролеина (ДААк); – сополимеризация МАГ с ВП и ДААк; – удаление диэтилацетальной защиты. Продукты: I – МАГ; II – пМАГ; III – окисленная пМАГ; IV – сополимер МАГ с ВП (п(МАГ-со-ВП)); V – окисленный п(МАГ-со-ВП); VI – сополимер МАГ с ВП и ДААк (п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)); VII - п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) после удаления диэтилацетальной защиты с - п(МАГ-со-ВП-со-Ак).

Первый метод заключается в полимераналогичном превращении предварительно синтезированного гомополимера МАГ (пМАГ) в альдегид-содержащий сополимер путем периодатного окисления (Рис. 1, реакция 2б) сахаридных звеньев. Также было проведено окисление сополимера МАГ с N-винилпирролидоном (п(МАГ-со-ВП)) (Рис. 1, реакция 3б), синтезированного, исходя из предположения о положительном влиянии винилпирролидона на адсорбцию полимера на минеральной матрице. Вторым методом является сополимеризация МАГ с альдегидсодержащим мономером (в нашем случае, диэтилацеталем акролеина, ДААк). Было установлено, что прямая сополимеризация МАГ с ДААк (Рис. 1, реакция 4) приводит к образованию практически гомополимера МАГ, содержащего следовые количества ДААк. С другой стороны, известно, что ДААк и МАГ достаточно легко образуют сополимеры с N-винилпирролидоном. Поэтому ВП был использован в качестве интермедиата для введения ДААк в структуру поливинилсахарида (Рис. 1, реакция 5а).

Образование сополимеров п(МАГ-со-ВП) и п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) (Рис. 1, продукты IV и VI) было доказано методами ЯМР спектроскопии. Наличие альдегидных групп в продуктах III, V и VII (Рис. 1) было качественно подтверждено методом ИК-спектроскопии путем идентификации полос в области 1740 – 1755 см-1.

При синтезе полимерной составляющей гибридного скаффолда необходимо обеспечить оптимальную величину ее молекулярной массы (ММ), гарантирующую, с одной стороны, адсорбцию на матрице, но, с другой, не препятствующую выводу полимера из организма при его возможной десорбции. Обычно значения ММ биологически значимых полимеров лежат в пределах 10000-30000. Для пМАГ это требование выполнялось путем подбора условий синтеза ([МАГ] = 10 масс%, [АИБН] = 5 масс%, ДМФА, выход 98%), в случае п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) учитывалось введение ДААк, которое приводит к уменьшению ММ продуктов сополимеризации.

Таблица 1

Окисление пМАГ

Полимер

[NaIO4]:[ МАГ], моль

[CHO], моль%

1

пМАГ

2.0

55

2

-“-

1.0

40

3

-“-

0.7

30

4

-“-

0.3

10

Необходимая биофункционализация поверхности полимерно-неорганического скаффолда достигается, в первую очередь, контролируемым введением альдегидных групп в синтезированный водорастворимый полимер. Экспериментально показано, что увеличение концентрации периодата при окислении гомополимера МАГ приводит к увеличению количества генерируемых альдегидных групп (Таблица 1). Более высокая реакционная способность МАГ приводит к тому, что сополимеры МАГ с ВП и ДААк в большей степени насыщены звеньями МАГ.

Содержание ДААк в тройных сополимерах значительно ниже, чем в исходной мономерной смеси, что может быть объяснено его способностью к деградационному переносу в процессе роста цепи, приводящему к уменьшению выхода продукта и его молекулярной массы. Однако, количество введенного в сополимер ДААк, и, следовательно, альдегидных групп, можно варьировать путем изменения количества ВП в исходной реакционной смеси (Таблица 2).

Таблица 2

Сополимеризация МАГ (М1) с ВП (М2) и ДААк (М3)

Сополимер

Условия сополимеризации

Характеристики сополимеров

Соотношение мономеров,

моль%

[M1+M2

(+M3)],

масс%

[АИБН],

масс% от

[M1+M2(+M3)]

Выход %

[m1]:[m2](:[m3])

моль%

M•

10-4

5

п(МАГ-со-ВП)

50 : 50

10

4

60

77 : 23

2.40

6

п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)

30 : 30 : 40

40

1

39

82 : 15 : 3

2.00

7

п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)

20 : 40 : 40

40

1

31

79 : 16 : 5

1.75

8

п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)

15 : 45 : 40

40

1

22

75 : 18 : 7

1.35

Таким образом, использование двух описанных подходов позволило получить новые альдегид-содержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахаридов, со значениями ММ, удовлетворяющими требованиям к полимерам-носителям.

3.2. Биофункционализация полученных полимеров-носителей

Согласно предложенной стратегии получения полимерно-неорганических скаффолдов, в его состав должен входить адсорбированный на поверхности компонент, управляющий поведением клеток (так называемый полибиофункциональный полимерный «вектор»). Создание такого «вектора» основано на ковалентном связывании с полученными альдегид-содержащими полимерами специальных биологических молекул (биолигандов), оказывающих различное влияние на клетки.

Для повышения эффективности процесса выращивания костной ткани в лабораторных условиях существует необходимость интенсифицирования стадий прикрепления (адгезии), миграции, роста и дифференциации клеток на поверхности используемых для этой цели каркасов. В данной работе были использованы три типа биолигандов, способных оказывать влияние на перечисленные процессы, а именно: положительно заряженный поли-L-лизин в качестве фактора, повышающего неспецифическую адгезию клеток за счет электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными мембранами клеток; GRGDSP-пептид, способствующий специфическому прикреплению клеток посредством комплементарного взаимодействия с поверхностными белками клеточных мембран; фактор роста и дифференциации клеток – костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein, BMP-2). В связи с высокой стоимостью BMP-2, в модельных in vitro экспериментах использовали доступный аналог - рибонуклеазу А (РНКазу), обладающую близкими физико-химическими свойствами (значениями изоэлектрической точки и молекулярной массы).

Конъюгаты с одним лигандом (моноконъюгаты)

Связывание GRGDSP-пептида. Схема ковалентного связывания данного лиганда с окисленной пМАГ и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) представлена на Рис. 2.

Для получения количественных данных использовали введение в пептид флуоресцентной метки. На основании полученных результатов сделан вывод о том, что данная реакция контролируется диффузией пептида к СНО-группам полимера.

Рис. 2. Экспериментальная схема изучения процесса ковалентного связывания GRGDSP- пептида с альдегид-содержащими полимерами.

В случае окисленного гомополимера МАГ, практически полная конверсия альдегидных групп достигается при двукратном избытке пептида, тогда как для тройного сополимера тот же результат достигался только при десятикратном избытке лиганда (Таблица 3).

Таким образом, количество введенного в полимер пептидного лиганда можно легко регулировать, подбирая необходимое молярное соотношение [CHO]ПОЛИМЕР : [NH2]ПЕПТИД.

Таблица 3

Модификация пМАГ и п(МАГ-co-ВП-co-Ак) GRGDSP пептидом

[CHO]полим:[NH2]GRGDSP, моль

Конверсия CHO групп, моль%

пМАГ

1.0

75

0.5

94

п(МАГ-co-ВП-co-Ак)

1.0

40

0.5

50

0.2

63

0.1

93

пМАГ - 30 моль% CHO-групп, MM 20000; п(МАГ-со-ВП-со-Ак) - 7 моль% CHO-групп, MM 13500. Условия реакции: 0.01 M натрий-боратный буфер, pH 10.0, 25°C, 2 ч при перемешивании (550 rpm). Очистка: ультрафильтрация (MWCO: 3,000) против воды. Конверсия альдегидных групп, измеряемая количеством конъюгированного с полимером пептида, определялась флуорометрически (ex.= 355 нм, em.= 485 нм), используя значения флуоресценции данзилкадаверина.

Связывание РНКазы (BMP-2) (Рис. 3). Доступность альдегидных групп полимеров для аминогрупп белка ограничена вследствие стерических препятствий, обусловленных структурой реагирующих макромолекул в растворе.

Рис. 3. Схема, использованная для изучения связывания модельного белка РНКазы с альдегид-содержащими полимерами.

Кроме того, оба типа реагирующих макромолекул содержат в своем составе достаточное количество реакционно-способных групп (СНО и NH2), способных образовывать межмолекулярные сшивки, в том числе, с образованием нерастворимых продуктов реакции. Исходя из этого, для снижения риска межмолекулярного взаимодействия групп и увеличения конверсии РНКазы использовали избыток полимеров, а, следовательно, альдегидных групп, по отношению к белку.

Из данных Таблицы 4 очевидно, что при одинаковых массовых соотношениях большее количество РНКазы связывается с сополимером п(МАГ-со-ВП-со-Ак), чем с окисленной пМАГ. Данный результат можно объяснить большей стерической доступностью для аминогрупп белка альдегидных групп п(МАГ-со-ВП-со-Ак) по сравнению с окисленной пМАГ.

Полученные данные подтверждают возможность контролируемого введения фактора роста и дифференциации клеток BMP-2 в состав создаваемых скаффолдов путем регулирования избытка альдегидных групп полимера по отношению к белку.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»