WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

При оценке суммарного количества сокращающихся кластеров в период их максимума было обнаружено, что достоверное отличие имелось как в опыте по сравнению с контрольными группами, так и в контролях между собой (p<0,01 по критерию Манна-Уитни). Полученные результаты дают основание полагать, что количество сокращений в ЭТ, культивированных в условиях клиностатирования (72 ч), снижено, а постоянное перемешивание среды также приводит к уменьшению числа сокращающихся кластеров.

Для подтверждения присутствия в ЭТ кардиомиоцитов было проведено иммуноцитохимическое окрашивание дифференцированных ЭСК антителами к тропонину I – клеточному маркеру, который, как известно, экспрессируется в дифференцированных кардиомиоцитах [Wei H., et al., 2005]. Из рис. 12 (стрелками указаны окрашенные клетки) видно, что количество предшественников кардиомиоцитов на 18 сутки после клиностатирования больше в контроле, что подтверждает ослабление спонтанной дифференцировки в опыте.

Ранее было показано [Landis W.J. et al., 2000], что при использовании первичной культуры остеобластов, выделенных из черепной кости куриного эмбриона, в условиях микрогравитации происходит снижение дифференцировки этих клеток, сопровождающееся уменьшением синтеза внеклеточного матрикса (снижение экспрессии коллагена).

Подтверждением предположения о возможной задержке эмбрионального развития при снижении гравитационного стимула в условиях космического полета могут быть работы Л. В. Серовой, посвященные изучению развития эмбрионов крыс in vivo, а также других авторов, изучавших развитие эмбрионов перепелов [Серова Л. В.,1996; Мелешко и др, 1991; Гурьева и др, 1993].

Нейрональная дифференцировка. Известно, что одним из направлений дифференцировки ЭСК мыши in vitro является дифференцировка в клетки нервной системы [Guan et al, 1998]. Одной из задач данной работы являлось исследование влияния клиностатирования на способность клеток к спонтанной дифференцировке в нейрональном направлении. Оценка степени нейрональной дифференцировки проводилась с помощью антител к специфическим белкам нервных клеток: MAP2 (MAP-microtubule associated proteins) и -III тубулину. Ранее было показано, что спонтанная дифференцировка в нейрональные клетки происходит через 15-20 сут после прикрепления ЭТ [Strbing C. et al., 1995]. При этом максимальное количество MAP2-положительных нейронов, дифференцированных из ЭСК мыши in vitro, выявлялось примерно на 18-20 день культивирования [Fraichard A., et al, 1995]. В связи с вышеизложенным в нашем исследовании иммуноцитохимическое окрашивание ЭСК на два специфических белка (-III тубулина и MAP2) осуществляли через 18 суток после начала культивирования ЭТ.

MAP2-положительные и -III тубулин-положительные клетки были обнаружены во всех вариантах исследования (опыт, статический контроль - сК и динамический контроль - дК) (рис. 13, 14). Морфологически они представляли клетки с короткими и длинными отростками. Количественный анализ полученных результатов показал, что число -III тубулин-положительных нейронов в опыте достоверно выше по сравнению с серией сК и ниже по сравнению с серией дК. Кроме того, обнаружены достоверные отличия числа -III тубулин-положительных клеток в серии дК по сравнению с серией сК (p<0,05 по критерию Манн-Уитни) (табл. 2).

Таблица 2. Количество нейрональных клеток, выявленных на 18-е сутки специфическими антителами к MAP2 и -III тубулин.

опыт

сК

дК

-III тубулин-положительные нейроны

(в расчете на лунку – 1,8 см2)

66±12*

n=16

35±10

n=8

211±21&,$

n=6

MAP2-положительные нейроны

(в расчете на лунку- 1,8 см2)

24±7

n=12

31±11

n=12

28±12

n=12

* отличия между опытом и сК; & - между дК и опытом; $ - между дК и сК, p<0,05;

n – количество лунок.

Количество MAP2-положительных клеток в клиностатируемых ЭТ было несколько меньше по сравнению с серией дК. Достоверных отличий от серии сК также не было найдено, была выявлена лишь тенденция к их снижению (табл.2).

Анализ экспрессии маркера нейрональной дифференцировки - MAP2 позволяет предположить, что постоянное перемешивание среды культивирования незначительно активировало, а условия клиностатирования (48 ч) снижали спонтанную дифференцировку клеток. По-видимому, в этих условиях из-за того, что ЭТ дольше находились в неприкрепленном состоянии, происходила задержка их последующего развития. Немаловажным здесь является то, что полученные данные в опыте и дК практически сопоставимы, это можно объяснить правильным подбором условий постоянного перемешивания культуральной среды как на горизонтальном шейкере, так и в условиях клиностата.

Таким образом, данные, показывающие снижение экспрессии маркеров поздних стадий нейрональной дифференцировки, согласуются с результатами, полученными при изучении спонтанной дифференцировки ЭСК в кардиомиоциты, где было показано уменьшение числа сокращающихся кластеров в ЭТ после культивирования в условиях измененной гравитации. Обнаружение в клиностатируемых культурах большого числа клеток, окрашенных на -III тубулин (на 18 сутки) может быть связано с тем, что дифференцировка существенной части ЭСК останавливалась на стадии нейробластов, а терминальной стадии дифференцировки достигали значительно меньшие количество клеток. Предполагается, что клиностатирование создает условия для определенной задержки дифференцировки ЭСК в нейрональном направлении применительно к поздним стадиям этого процесса. К тому же нейрональные клетки являются производные эктодермы, а кардиомиоциты – производные мезодермы, что может влиять на различия в экспрессии двух исследуемых маркеров (-III тубулин и тропонин I) при моделировании эффектов гипогравитации.

Рис. 12. Иммуноцитохимическое

окрашивание дифференцированных

ЭСК антителами к тропoнину I

через 18 суток после клиностатирования:

А-опыт (х200); Б-контроль (х200).

Стрелкой указаны окрашенные клетки.

Рис. 13. Окраска дифференцированных клеток из ЭТ на специфический маркер MAP2 (х200): а - сК; б - опыт; в – дК.

Рис. 14. Окраска дифференцированных клеток из ЭТ на специфический маркер -III-тубулин ( х200): г – сК; д – опыт; е –дК.

Изучение морфологии эмбриоидных тел после действия клиностатирования.

Анализ полутонких срезов ЭТ (100 срезов) показал три стадии их созревания как в опыте, так и в контролях: сформированные ЭТ без базальной мембраны (а), ограничивающей внутренний слой клеток от внешних; с частично образованной мембраной (б) и полностью сформированные, созревшие ЭТ с четко выраженной мембраной (в) (представлены контрольные группы ЭТ) (рис.15). Так как с момента пассирования ЭСК для получения ЭТ до момента фиксации образцов прошло 7-8 суток, вполне возможно, что некоторые ЭТ уже достигли полной стадии созревания, а другие – нет, при этом аналогичная картина была обнаружено как в опыте, так и в контроле.

Рис. 15. Полутонкие срезы ЭТ. Три стадии созревания ЭТ (на примере контрольной группы): а – без базальной мембраны; б – с частично сформированной базальной мембраной; в – с полностью сформированной базальной мембраной (увелич. х400).

Рис. 16. Полутонкие срезы ЭТ (толщина 1-2 мкм). Окраска метиленовым синим-азуром-фуксином: а – контроль; б – опыт (увелич. х400). Толстые стрелки - пустоты и ядра апоптотических клеток. Тонкие стрелки - клетки внешнего слоя.

Рис. 17. Полутонкие срезы ЭТ (толщина 1-2 мкм). Окраска метиленовым синим-азуром-фуксином (увелич. х 400): а – контроль; б – опыт. Стрелки – полости кавитации.

Как видно из рис. 15, ЭТ без базальной мембраны состоят из однотипных клеток, плотно прилегающих друг к другу. В ЭТ, где была четко сформирована базальная мембрана, видны вакуолизированные области. Они представлены как во внутреннем, так и во внешнем слое, где, как известно, клетки более дифференцированы [Гордеева и др., 2002]. К тому же, в сформированных ЭТ во внутреннем пуле клеток, где были обнаруживали пустоты, встречались клетки с фрагментированными ядрами и с сильно конденсированным хроматином, расположенным зачастую по периферии ядер, что указывает на процессы апоптоза [Ярилин А.А., 1998; Самуилов В.Д. и др., 2000]. Данные литературы свидетельствуют, что апоптотические клетки располагаются в основном в центре ЭТ [Мануилова Е.С. и др., 2001; Гордеева О.Ф. и др., 2002]. Однако в нашем исследовании их можно было встретить не только в центре, но и по всему пространству внутреннего слоя ЭТ.

Во внешнем слое были обнаружены клетки, имеющие отростки (рис. 16), что подтверждает данные других исследователей [Saitou M. et al., 1998; Мануилова Е.С. и др., 2001], и говорит о начале процессов дифференцировки. Из рис. 16 видно также, что в опыте клетки внутреннего слоя расположены менее плотно, чем в контроле, и в них можно обнаружить фрагментированные ядра.

Xuepig Qu et al (2007) при исследовании морфологии ЭТ изучали процесс аутофагии, т.е. уничтожение здоровыми клетками мертвых клеток, при котором происходит образование полостей (процесс кавитации), с целью сохранения жизнеспособных свойств целого организма. Аутофагия может быть активирована in vivo как клеточный защитный механизм [Levine, 2005]. При эмбриональном развитии млекопитающих ранним сигналом процессов апоптоза является кавитация, т.е. когда часть клеток эмбриональной эктодермы, уходя в апоптоз, формируют впадину [Coucouvanis and Martin, 1995]. Этот процесс в условиях in vitro может быть воспроизведен при культивировании ЭСК без «фидерной» подложки и без добавления фактора LIF [Poirier et al., 1991]. В наших экспериментах, как можно видеть из рис. 17, в ЭТ контроле в центральной части располагались достаточно большие по размеру пустоты (показано стрелками) по сравнению с ЭТ опытом. Причем вокруг них можно было встретить клетки, по морфологическим признакам напоминающие эпителий.

Показано (рис. 18) существенно меньшее количество апоптотических клеток, приходящихся на 1 мм2 площади среза ЭТ в опыте по сравнению с контролем (p<0,01; критерий Манна-Уитни; n1=24 (опыт), n2=67 (контроль)). При этом относительная площадь полостей в опыте достоверно ниже таковой в контроле (p<0,05; критерий Манна-Уитни; n1=24, n2=70) (рис. 19).

Таким образом, возможно, что отсутствие больших полостей при клиностатировании может быть связано с замедлением процесса аутофагии и морфогенеза в ЭТ. Эти изменения могли быть причиной последующей задержки дифференцировки, обнаруженной нами после клиностатирования.

Рис. 18. Число ЭСК мыши, вступивших в апоптоз, в расчете на 1 мм2 площади полутонкого среза ЭТ.

Рис. 19. Относительная площадь

полостей на полутонком срезе ЭТ.

ВЫВОДЫ

  1. Подобрана и успешно апробирована экспериментальная модель для исследования начальных этапов дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.
  2. Клиностатирование (72 ч) эмбриональных стволовых клеток мыши на подложке из эмбриональных фибробластов не оказывало выраженного влияния на их образование колоний. Культивирование ЭСК при добавлении фактора LIF в тех же условиях на 80 % снижало этот процесс.
  3. Выявлена тенденция к увеличению жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток при их пассировании после клиностатирования, при этом образование эмбриоидных тел было снижено.
  4. Показано, что при клиностатировании в эмбриоидных телах обнаруживалось меньшее число апоптотических клеток и существенно снижалась активность процессов аутофагии.
  5. Клиностатирование эмбриоидных тел приводило к замедлению начала дифференцировки клеток в кардиомиоциты и к уменьшению количества спонтанно сокращающихся кластеров в 2 раза.
  6. Клиностатирование эмбриоидных тел существенно увеличивало количество -III тубулин-положительных клеток и незначительно снижало число MAP2-положительных клеток в ходе спонтанной нейрональной дифференцировки.
  7. Показано, что эмбриоидные тела являются уникальной моделью для изучения начальных этапов дифференцировки в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

РЕКОМЕНДАЦИИ

  • Для моделирования эффектов микрогравитации в наземных условиях при использовании ЭСК на стадии колоний рекомендуется применять экспозиции от 24 до 72 ч и фидерную подложку для их культивирования.
  • Клиностатирование культивируемых ЭСК мыши с малыми скоростями может быть использовано для поддержания недифференцированного состояния.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Константинова Н.А. Отработка экспериментальной модели для клиностатирования эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // Тезисы конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2005. С. 25.

2. Константинова Н.А., Мануилова Е.С., Гривенников И.А., Буравкова Л.Б. Изучение эффектов постоянного измененного вектора гравитации (клиностатирование) на эмбриональные стволовые клетки мыши in vitro // Тезисы VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток. Звенигород. 2005. С. 96.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»