WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Развитие технологии культивирования ЭСК in vitro позволяет использовать эту уникальную модель для анализа гравитационных эффектов на клеточные механизмы начальных стадий эмбрионального развития. Поскольку ЭСК обладают неограниченной пролиферативной активностью, находясь в недифференцированном состоянии [Evans M.J., 1981; Guan K. et al., 1998], было важно оценить пролиферацию, а также морфологию колоний при измененных условиях гравитационного стимула. Кроме того, необходимо было сравнить эффективность использования фидера или LIF при клиностатировании для поддержания клеток в недифференцированном состоянии.

Рис. 1. Культура ЭСК на подложке из эмбриональных фибробластов мыши через 72 ч клиностатирования (увелич. х100):

А) сК-статический контроль; б) дК-динамический контроль; в) клиностат.

Было проведено 5 серий исследований по клиностатированию ЭСК в течение 72 ч на подложке из эмбриональных фибробластов. Анализ экспериментальных образцов показал, что ЭСК активно образовывали колонии вплоть до 72-х ч клиностатирования. Необходимо отметить, что в опыте колонии имели более четкие границы по сравнению с контролями (рис. 1).

Для оценки морфологических характеристик была проведена морфометрия площади, периметра, максимального и минимального диаметров колоний с использованием компьютерной программы SigmaScan Pro5. Затем колонии были разделены по размерам: малые - 400-1081 мкм2 (I группа), средние – 1082-2442 мкм2 (II группа), большие - 2443-5163 мкм2 (III группа). Выявлено, что в первые сутки клиностатирования колонии характеризовались меньшими размерами по сравнению с сК и дК, однако к концу эксперимента (72 ч) видимых различий по размерам колоний ЭСК во всех трех образцах не было обнаружено (рис. 2).

Некоторое отставание пролиферативной активности ЭСК в первые часы клиностатирования сменилось увеличением количества клеток в разных колониях после «адаптации» к измененным условиям культивирования. Возможно, здесь имело место увеличение времени цикла клеточного деления у ЭСК в условиях клиностатирования.

Количественный анализ числа колоний позволил установить, что наибольшая пролиферативная активность клеток всех образцов наблюдалась между первыми и вторыми сутками экспериментального воздействия (рис. 3). К 48-му ч клиностатирования образование колоний в опыте было снижено по сравнению с серией дК, но уже спустя сутки (к 72-му ч) количество колоний ЭСК в опыте приблизилось к серии дК, и почти в 2 раза было выше, чем в серии сК.

Постоянное перемешивание среды в данном случае также можно рассматривать, как дополнительный фактор воздействия на клетку. Видно, что в серии дК происходило увеличение колониеобразования по сравнению со статическим контролем, однако другие параметры колоний, их суммарные размеры в контролях существенно не отличались. Достоверных различий между экспериментальными сериями (клиностатируемые клетки, сК, дК) не выявлено (p<0,2, по критерию Крускала-Уоллиса).

Рис. 2. Динамика распределения

колонии ЭСК мыши по площадям

при клиностатировании (72 ч).

Рис. 3. Образование колоний ЭСК

в ходе клиностатирования (72 ч).

Для каждого образца исследовано

6 полей зрения (1,5 мм2).

Полученные нами результаты по оценке пролиферативной активности вполне согласуются с данными, описанными в литературе, где не было выявлено достоверных изменений пролиферации различных эмбриональных клеток [Жуков-Вережников и др., 1963; 1971; Montgomery PO’B, 1978; Lorenzi G. et. at., 1993; Gaubin Y. et. al., 1991]. Отсутствие влияния клиностатирования на пролиферацию культивируемых ЭСК мыши, возможно, объясняется тем, что клетки, находящиеся на самой ранней стадии развития, менее подвержены действию механического стресса. Однако стоит отметить, что нахождение ЭСК мыши под постоянным ламинарным потоком может влиять на состояние хроматина ЭСК и вызывать дифференцировку в предшественники кардиомиоцитов [Barbara I. et al, 2005].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что культивирование ЭСК в условиях клиностатирования не приводило к выраженным изменениям колониеобразования ЭСК мыши in vitro, а постоянное перемешивание среды культивирование как дополнительный фактор воздействия, вызывал стимуляцию колониеобразования ЭСК мыши по сравнению со статическим контролем.

Влияние клиностатирования на образование колоний эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1, культивируемых в присутствии фактора LIF.

Оценку образования колоний ЭСК в присутствии LIF в условиях клиностатирования проводили аналогично экспериментам с использованием «фидера». При этом культивирование клеток осуществляли как на флаконах, так и на чашках Петри (на желатиновой подложке) в течение 48 ч. Показано, что через 24 ч клиностатирования количество колоний ЭСК, наблюдаемое в фиксированных полях зрения, снижалось по сравнению с контролем. Возможно, колонии ЭСК при наличии в среде культивирования LIF в опыте откреплялись от поверхности из-за снижения адгезии (рис. 4). На протяжении всего эксперимента количество колоний ЭСК было достоверно ниже в опыте по сравнению с контролем (p<0,05 по критерию Манна-Уитни) (рис.5). Дополнительное использование желатиновой подложки на чашках Петри привело к увеличению размеров колоний в опыте, что не наблюдалось при клиностатировании ЭСК во флаконах на желатиновой подложке с добавлением LIF (рис. 6). При подсчете колоний клеток, посеянных на чашках Петри с добавлением LIF, показано статистически незначимое их снижение в опыте по сравнению с контролем (рис. 7). Таким образом, в условиях клиностатирования подложка из эмбриональных фибробластов мыши способствует пролиферации ЭСК, по-видимому, за счет выделяемых факторов роста, а также увеличения межклеточных контактов и адгезии двух типов культивируемых клеток. Полученные результаты показывают, что в экспериментах с клиностатированием ЭСК мыши предпочтительнее использовать «фидерную» подложку, а не LIF, для сохранения недифференцированного состояния клеток.

Рис.4.Колонии ЭСК,

культивированные с

добавлением LIF (увелич. х100):

а – контроль; б – опыт

(клиностатирование 48 ч)

Рис. 5. Число колоний ЭСК при

культивировании на флаконах

в присутствииLIF

при клиностатировании (48 ч).

Исследовано 6 полей зрения

для каждого образца (1,5 мм2).

* - отличие между

опытом и контролем, p<0,05

Рис. 6. Культура ЭСК,

культивированная

с добавлением LIF

(увелич. х100):

а - контроль; б – опыт (48 ч)

(чашки Петри).

Рис.7. Число колоний ЭСК при

культивировании на чашках Петри

в присутствии LIF

в ходе клиностатирования (48 ч).

Исследовано 6 полей зрения

для каждого образца (1,5 мм2).

Оценка жизнеспособности клеток и образование эмбриоидных тел после действия клиностатирования.

Оценку жизнеспособности ЭСК и их способность образовывать ЭТ проводили в период после воздействия клиностатирования (72 ч) в последующих пассажах ЭСК (рис. 8, рис. 9, табл. 1). Образование ЭТ отражает вступление клеток на начальные стадии дифференцировки, которые могут изменяться под действием различных физических, химических и биологических факторов [Wobus A.M. et al. 1991; Strbing C. et al., 1995; Guan K. et al., 1999; Гордеева О.Ф. и др, 2003].

Колонии ЭСК были правильной формой во всех экспериментальных сериях. Количество клеток в одной колонии (p<0,05 по критериям Дана и Манна-Уитни) значимо превосходило в опыте по сравнению с динамическим и статическим контролями. Можно сказать, что клетки в периоде последействия, как и во время клиностатирования хорошо формировали колонии, которые характеризовались разными размерами (табл. 1).

Анализ общей жизнеспособности ЭСК мыши (образование колоний в следующем пассаже) не выявил достоверных отличий между опытом и контролями. Была показана лишь тенденция к увеличению этого показателя у ЭСК после клиностатирования (табл. 1).

Оценка жизнеспособности ЭСК мыши в периоде последействия в серии исследований при культивировании клеток с добавлением LIF в условиях клиностатирования не выявила отличий между опытом и контролями.

Рис.8. Культура ЭСК после воздействия клиностатирования на желатиновой подложке с добавлением LIF (увелич. х100): сК – статический контроль; дК – динамический контроль; опыт (72 ч клиностатирования).

Таблица 1.Число колоний ЭСК и ЭТ спустя 4 суток

после воздействия клиностатирования

Величина

Клиностатирование

сК

дК

Кол-во колоний/ см2

208±42

160±8

151±16

Кол-во клеток в одной колонии

168±49*,&

60±8

57±20

Кол-во ЭТ/1 мл

6729±2318

8424±888

4025±2941

* отличия между опытом и сК;,& отличия между опытом и дК, p<0,05.

Оценку начальных стадий дифференцировки ЭСК мыши после воздействия клиностатирования (72 ч) проводили методом подсчета образованных ЭТ во всех образцах (табл. 1). Визуально можно было отметить, что ЭТ в опыте отличались меньшими размерами по сравнению с контролями, а более крупные по размеру ЭТ наблюдали в серии дК (рис. 9).

Рис. 9. ЭТ, образуемые ЭСК после воздействия клиностатирования (увелич. х100):

сК – статический контроль; дК – динамический контроль; опыт (72 ч клиностатирования).

Анализ полученных данных показал, что количество образованных ЭТ в опыте имело тенденцию к уменьшению по сравнению с серией сК и тенденцию к увеличению по сравнению с серией дК (табл. 1). Следует отметить, что в серии дК встречались единичные ЭТ, имеющие больший размер и четко выраженную базальную мембрану, что говорит о полностью сформированной их структуре.

На основании отсутствия изменений в образовании колоний ЭСК можно предположить, что недифференцированные клетки не реагируют на гравитационные изменения существенными сдвигами пролиферации. Однако, выявление некоторого запаздывания дифференцировки клеток в периоде последействия клиностатирования (уменьшение образования ЭТ) и повышение жизнеспособности может говорить об относительно небольшом влиянии измененной гравитации на последующее развитие клеток на данной стадии.

Исследование влияния клиностатирования эмбриоидных тел на последующую дифференцировку клеток in vitro.

Кардиомиоцитарная дифференцировка. Для изучения вклада гравитационного фактора в коммитирование ЭСК изучали их спонтанную дифференцировку в кардиомиоциты после клиностатирования (72 ч).

В ходе 5 серий экспериментов по влиянию клиностатирования на ЭТ (72 ч) in vitro было показано, что ЭТ в трех образцах (сК-статический контроль, дК-динамический контроль и клиностат) имели разную морфологию (рис. 10). Больше половины ЭТ при клиностатировании (72 ч) находились в суспензионном виде в течение всего эксперимента. В серии сК почти 80 % ЭТ прикреплялись ко дну флакона в первые сутки эксперимента, а в серии дК ЭТ находились как в суспензионном состоянии, так и в адгезивном. На момент окончания воздействия визуально было обнаружено, что клиностатируемые ЭТ отличались более ровной и округлой формой (рис. 10). Можно предположить, что отсутствие или снижение процессов седиментации, позволяющее ЭТ длительное время находиться во взвешенном состоянии, впоследствии приведет к замедлению миграции клеток из ЭТ и их спонтанной дифференцировки.

В периоде последействия проводили наблюдение за появлением сокращающихся кластеров кардиомиоцитов. Было отмечено, что в обеих контрольных сериях появление сокращающихся кластеров происходило на 3-ий день после завершения эксперимента, в отличие от опыта, где была выявлена задержка на 2 дня. Таким образом, спонтанная дифференцировка в кардиомиоциты в условиях измененной гравитации начиналась с опозданием.

Время сокращений во всех трех группах продолжалось в течение 14 суток (рис. 11). Как видно из результатов, представленных на графике наибольшее число кластеров сокращающихся кардиомиоцитов (вплоть до 10-х суток после клиностатирования) было обнаружено в статическом контроле, а наименьшее в культурах после клиностатирования.

Рис. 10. Внешний вид ЭТ при клиностатировании (увелич. х200):

сК - статический контроль, дК - динамический контроль, Кл - опыт.

Рис. 11. Динамика появления сокращающихся кластеров

кардиомиоцитов в ЭТ после остановки клиностатирования:

Кл - опыт, сК - статический контроль, дК- динамический контроль.

Максимальное число сокращений в ЭТ для статического и динамического контролей наблюдали на 7-е сутки после клиностатирования (5-й день сокращения), а для клиностатируемых ЭТ на 11-е (7-й день сокращения). Данные других исследователей, описывающие спонтанную дифференцировку ЭСК мыши в кардио-мышечном направлении, говорят о появлении первых сокращающихся кластеров на сроках 2-3 суток после прикрепления ЭТ к подложке [Guan et al., 1998; Wei H. et al., 2005], что согласуется с результатами, полученными нами в контроле.

Результаты статистической обработки показали достоверные различия по времени, в течение которого сокращались кластеры кардиомиоцитов в исследуемых группах (рис. 11). Таким образом, после воздействия длительного клиностатирования ЭТ (72 ч) in vitro происходило существенное запаздывание по времени начала дифференцировки ЭСК в ЭТ (p<0,01, по критерию Фридмана).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»